17-AAG對MCF-7細胞增殖的抑制作用及對STAT3和VEGF表達的影響

肖麗君，趙恩宏，趙爽，高藝銘，郭璐，許倩

（承德醫學院1.免疫教研室；2.附屬醫院腫瘤外科；3.基礎醫學研究所，河北 承德06 7020）

乳腺癌的發病率和死亡率逐年升高，侵襲和轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因。熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）可與乳腺癌細胞中的多種信號分子和激酶結合形成復合物，參與調控乳腺癌的侵襲和轉移［1］。17-烯丙胺-17-脫甲氧格爾德霉素（17-allylamino-17-desmethoxy-geldanamycin，17-AAG）可強烈抑制HSP90，從而通過降解客戶蛋白、誘導腫瘤凋亡、干擾細胞周期等抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。研究表明，17-AAG抗乳腺癌作用顯著［2］。本研究擬觀察17-AAG對乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用及對細胞信號轉導和轉錄活化蛋白3（signal transducer and activator of transcriptions3，STAT3）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 和蛋白表達的影響，旨在為17-AAG抗乳腺癌作用探尋新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑：人乳腺癌MCF-7細胞株由承德醫學院附屬醫院中心實驗室饋贈。DMEM培養基（美國GIBCO BRL公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；MTT（美國Peprotech公司）；Trizol總RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；RT-PCR（AMV）試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物及內參（上海生物工程技術有限公司）；溴化乙錠（美國GIBCO BRL公司）；STAT3單克隆抗體（美國Epitmics公司）；VEGF、β-actin單克隆抗體（美國 Santa Cruz公司）；辣根酶標記羊抗兔和羊抗鼠IgG（美國KPL公司）；ECL超敏發光液（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.1.2 儀器：090-135.001倒置顯微鏡（德國Leica公司）；Sorvall/Biofuge fresco高速冷凍離心機、150培養箱（德國Heraeus公司）；MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）；Icycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）；96孔、6孔細胞培養板（美國Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：用含10%胎牛血清的DMEM培養基（添加1 mmol/L丙酮酸鈉，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/L青霉素及鏈霉素）于37℃、5%CO2培養箱中培養MCF-7細胞，每3 d換液1次，并傳代培養，培養細胞至對數生長期。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖情況：取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液。計數，離心，調整細胞濃度為5×104/mL。加入96孔板（190μL/孔），37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。向實驗組細胞加入17-AAG（終濃度：0.165、0.310、0.620、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/L），每個濃度設5 個復孔，同時設立對照組（不加藥）和空白對照組（不加細胞及培養液）。培養24h及48h后，加入MTT（5g/L，10μL/孔）。培養4 h后，棄上層培養液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，震蕩10 min，待藍色結晶完全溶解后，在酶標儀492、540、650 nm波長處檢測各孔OD值。計算17-AAG對腫瘤細胞的生長抑制率=（1－OD實驗組/OD對照組）×100%，做圖獲得劑量反應曲線，計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 RT-PCR檢測17-AAG作用后人乳腺癌MCF-7細胞株STAT3、VEGFmRNA的表達：取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104/mL，加入6孔板（3 mL/孔），37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，加入17-AAG（終濃度：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L），每個濃度設5 個復孔，同時設立對照組（不加藥組）。終止培養后，每孔加入500 μL Trizol提取液提取細胞總RNA，參照RTPCR試劑盒說明書進行操作，STAT3基因引物：上游：AGCGGGAAATCGTGCGTGAC，下游：ACATCTG CTGGAAGGTGGAC，擴增產物447 bp；VEGF基因引物：上游：ATCACGAAGTGGTGAAGTTC，下游：TGCTGTAGGAAGCTCATCTC，擴增產物265 bp；內參照β-actin基因引物：上游：AGCGGGAAATCGTG CGTGAC，下游：ACATCTGCTGGAAGGTGGAC，擴增產物453 bp。cDNA合成反應條件：30℃10 min，42℃30 min，99 ℃5 min，5 ℃5min；PCR 擴增反應條件：STAT3：94 ℃2min，94 ℃30 s，58 ℃30s，72 ℃ 45 s，28 個循環；VEGF：94 ℃2min，94 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃ 45 s，28 個循環；β-actin：94 ℃2min，94 ℃30s，58℃30 s，72℃1min，28個循環。取 PCR 產物行2%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min），拍照觀察。用Quantity One軟件進行圖像灰度分析。每組實驗至少重復5次，計算目的基因與內參照β-actin灰度比值。

1.2.4 Western blot檢測STAT3、VEGF蛋白的表達：取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，調整細胞濃度為5×104/mL，加入6孔板（3 mL/孔），37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，加入17-AAG（終濃度：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L），每個濃度設5 個復孔，同時設立對照組（不加藥）。48 h后終止培養，PBS洗細胞2次，加入預冷的細胞裂解液，冰上裂解20 min，4℃、12000 r/min離心20 min，收集上清，蛋白定量。取50 μg蛋白行8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，含5%脫脂奶粉TBS-T溶液封閉，室溫下與兔抗人STAT3、VEGF單克隆抗體（1︰300稀釋）孵育，再與相應的HR-PO抗Ig抗體耦聯物（1︰2000稀釋）孵育，以上各步驟間用TBS-T洗膜。ECL顯影，洗片。以β-actin（1︰100稀釋）作內參照。用Quantity one分析軟件測定圖像條帶灰度值，計算STAT3與VEGF的相對含量（STAT3、VEGF蛋白條帶灰度值/內參照β-actin蛋白條帶灰度值）。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 17-AAG對MCF-7細胞增殖的影響

MTT結果顯示：0.165～10.000 mg/L17-AAG對乳腺癌MCF-7細胞有顯著的抑制作用，且有明顯的量效關系；體外作用48 h細胞增殖抑制率（IC50均值6.22）優于24 h（IC50均值34.61）。見表1，圖1。

2.2 不同濃度17-AAG對MCF-7細胞STAT3、VEGFmRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示：17-AAG作用48 h后，實驗組MCF-7細胞中STAT3、VEGFmRNA的表達水平降低，呈濃度依賴性。實驗組與對照組、各實驗組之間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖2。

2.3 不同濃度17-AAG對MCF-7細胞STAT3、VEGF蛋白表達的影響

Western blot 結果顯 示：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L17-AAG作用48 h后，各實驗組細胞STAT3、VEGF蛋白的表達量逐漸降低，呈濃度依賴性。實驗組與對照組、各實驗組之間兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖3。

3 討論

目前已證實STAT3在多種人類惡性腫瘤組織及細胞系中存在高表達［3，4］。研究表明，當 STAT3 發生持續性激活時，一系列與細胞增殖、分化、凋亡等密切相關的基因出現異常的高表達，細胞向惡性轉化［5］。STAT3可能是1種癌基因，它參與的信號轉導途徑異?？赡茉谀[瘤的侵襲、轉移中起重要作用［6］。STAT3可通過調節多種激酶作用，破壞E-鈣黏著蛋白/b-鏈蛋白復合物，使b-鏈蛋白的酪氨酸磷酸化后從細胞膜釋放，使細胞間黏附能力下降，腫瘤細胞更易于脫離原發灶，從而促進腫瘤轉移［7］。

腫瘤細胞侵襲轉移到鄰近組織及遠處器官是1個多步驟的復雜的過程。腫瘤血管新生是腫瘤浸潤轉移必不可少的環節。VEGF是一種參與機體血管生成的細胞因子，也是迄今研究最多且最深入的腫瘤新生血管標志分子。它的啟動子位于－38 bp到－2274 bp，具有低氧誘導因子1、激活蛋白、早期生長應答因子l及STAT-3等多個因子的結合位點。VEGF的表達受諸多因素的調控，最近的研究表明，STAT3能直接調控VEGF的轉錄［8］，持續激活STAT3能誘導VEGF的表達，導致腫瘤新生血管形成；用STAT3的顯性負性突變體或反義寡核苷酸阻斷STAT3信號通路能抑制由Src和IL-6介導的VEGF的表達上調，從而抑制腫瘤的生長與侵襲轉移。阻斷STAT3的激活能抑制內皮細胞的遷移及微血管的形成［6］。提示VEGF/STAT3信號通路的激活可能是促進腫瘤新生血管形成的關鍵因素之一。

17-AAG是HSP90的抑制劑，可通過與HSP90特異性結合降解其客戶蛋白而發揮抗腫瘤作用。17-AAG的抗腫瘤（如乳腺癌、黑色素瘤等）研究已進入Ⅱ期臨床試驗［2，9］。17-AAG在抗侵襲和抗腫瘤血管新生方面的確切機制尚缺乏深入研究。Cheong等［10］報道，異澤蘭黃素可以通過阻斷胃癌MKN-45細胞的STAT3通路而抑制VEGF表達。本研究結果顯示：1.0、2.0、3.0 及5.0 mg/L17-AAG 作用人乳腺癌MCF-7細胞株12、24、48 h后，細胞內 STAT3和VEGFmRNA及蛋白表達均下調，且具有時間和濃度依賴性，尤其對STAT3的下調作用顯著。提示17-AAG可能通過阻斷STAT3通路而下調VEGF的表達，進而產生抗腫瘤血管新生作用。未來我們將對STAT3通路的上游或下游是否還存在其他直接或間接調控VEGF表達的因子進行進一步深入的研究。

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