谷胱甘肽S-轉移酶P1蛋白在肺癌中的表達及臨床病理學意義

陳傳萍，何群，潘忠誠，吳廣平，趙雨杰

（中國醫科大學1.生物芯片中心，衛生部細胞生物學重點實驗室，沈陽110001；2.附屬第一醫院病理科，沈陽110001）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，5年存活率約為10%～15%，已成為我國惡性腫瘤死亡原因的第一位［1］。目前對肺癌尚缺乏有效的早期診斷和治療手段，深入研究與肺癌發病機制相關的因子對提高肺癌的診斷率、早期發現腫瘤復發和轉移、監測療效以及判斷預后具有重要的意義。谷胱甘肽S-轉移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）是谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）家族的重要成員。研究發現，GSTP1在喉癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌、前列腺癌及卵巢癌等多種腫瘤組織中表達異常［2～11］，提示它與腫瘤的發生發展密切相關。GSTP1是肺臟重要的解毒酶，它在肺癌中的表達情況尚不清楚。本研究擬應用免疫組織化學和Western blot技術檢測GSTP1在肺癌組織中的表達，旨在探討其臨床病理學意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2006年1月至2011年12月中國醫科大學附屬第一醫院具有完整臨床資料的原發性肺腺癌手術切除標本50例，其中35例有完整隨訪資料。癌旁正常肺組織20例，肺轉移性腺癌11例，肺鱗癌14例。此外有8例肺腺癌、鱗癌及癌旁正常組織，取樣后立即置液氮中冷凍保存。

GSTP1羊抗鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司（sc-66000）；SP法免疫組織化學試劑盒、DAB顯色液購自福州邁新公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、上樣緩沖液、BCA定量及ECL發光試劑盒均購自上海碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學SP法：標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚度切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。3%過氧化氫室溫15 min去除內源性過氧化酶。PBS清洗后，置于檸檬酸緩沖液（pH6.0）121℃高壓熱抗原修復1 min，至自然冷卻，PBS清洗。滴加山羊血清，室溫封閉20 min。滴加一抗GSTP1（1︰500），4℃孵育過夜。次日室溫放置30 min后，PBS清洗，滴加鼠二抗，37℃10 min。PBS清洗，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，37℃10 min。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化后常規脫水，透明，封片后于光學顯微鏡下觀察結果。參照文獻［12］評分方法制定染色判斷標準。每張切片400倍顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野記數100個細胞，計算5個視野的陽性細胞的平均百分數，分為4級：1%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分；染色強度：無著色0分，淺黃色1分，黃或深黃色2分，褐或棕褐色3分。上述2項相乘為分級標準：≥4分定義為高表達。

1.2.2 Western blot：稱取50 mg冷凍保存的癌及癌旁正常組織，加入300 μL裂解液和4 μL蛋白酶抑制劑，冰上超聲裂解組織5 s，重復4次。靜置30 min后，12000 r/min 4℃離心10 min，收集上清-70℃保存。測定蛋白濃度，樣品均定量為5 μg/μL，每泳道上樣50 μg蛋白，SDS-PAGE 電泳，60 V 70 min電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（GSTP11︰500，GAPDH1︰1000）。4℃孵育過夜。TBST洗膜后，1︰5000羊抗鼠二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗，ECL發光并以凝膠顯像儀（MF-chemibis3.2 DNR，以色列）顯像。運用quantity one軟件，根據ECL發光成像后條帶和電泳條帶的面積和密度計算每個條帶的灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。免疫組化檢測癌與癌旁組織蛋白表達差異及GSTP1蛋白表達水平與患者臨床病理學參數的關系采用χ2檢驗。Western blot檢測GSTP1蛋白表達差異采用獨立樣本t檢驗。Kaplan-Meier計算累積生存率，Log-rank進行生存時間差異檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSTP1蛋白在肺癌組織中的表達

GSTP1在肺癌中呈胞核及胞質表達，在50例原發性肺腺癌及14例肺鱗癌組織中分別有32及9例呈高表達，明顯高于癌旁正常組織表達水平（χ2=6.665，P=0.010；χ2=3.927，P=0.048）（圖1，表1）。但GSTP1在原發性肺腺癌、肺鱗癌及肺轉移性腺癌中的表達無明顯差異（P>0.05）（表1）。

2.2 GSTP1蛋白表達與肺腺癌患者臨床病理學參數的關系

χ2檢驗結果顯示：GSTP1蛋白表達與肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度及淋巴結轉移均無明顯相關性（P>0.05）（表1）。

2.3 GSTP1蛋白表達與肺腺癌患者術后生存時間的關系

GSTP1高表達肺腺癌患者術后中位生存時間（37個月）明顯低于GSTP1低表達患者（47個月），差異有統計學意義（χ2=4.171，P=0.041）（圖2）。

2.4 Western blot結果

Western blot結果顯示：肺癌旁組織 GSTP1/GAPDH灰度比為0.249±0.057，腺癌組織為0.370±0.089，鱗癌組織為0.337±0.084。與癌旁組織相比，GSTP1在肺腺癌與鱗癌中表達明顯上調（t=2.545，P=0.023；t=2.337，P=0.035）（圖3）。

3 討論

研究發現，卵巢正常組織、良性病變及癌變組織中，GSTP1表達陽性率逐漸上升；腫瘤分化程度越低、臨床分期越晚其表達越強［11］；乳腺良性病變、乳腺癌組織中GSTP1表達水平明顯高于乳腺正常組織［5］；唾液腺腺樣囊性癌中GSTP1的表達也明顯高于癌旁腺體［13］。但在結腸癌及前列腺癌中，GSTP1低表達或缺失能夠促進腫瘤的發生［8，10］。此外，GSTP1可增強癌細胞對抗腫瘤藥物的代謝與轉運能力，使細胞產生抗藥性。提示GSTP1與腫瘤中發生、發展及化療耐藥密切相關［14］。本研究通過免疫組化和Western blot證實，GSTP1在肺腺癌及鱗癌中的表達明顯高于癌旁正常組織。雖然目前未見有關GSTP1在原發性肺腺癌、鱗癌及正常組織中表達差異的報道，但在非小細胞肺癌中已證實，GSTP1在腫瘤中表達水平明顯高于癌旁正常組織［3，4］。提示GSTP1在癌變組織內的高表達可能是一種誘導表達的結果，即其在腫瘤惡性轉變過程中被誘導激活而獲得較高的表達量，GSTP1基因的轉錄激活是化學致癌早期或啟動階段的重要分子事件，很可能是一個啟動信號或標志［15］。但GSTP1在不同病理類型及不同組織來源的肺癌中表達無明顯差異，這與韓志剛等［16］報道另一個GST家族成員GST-π在非小細胞肺癌、肺鱗癌及腺癌中表達的結果一致。提示GSTP1不能作為判斷肺癌病理類型及癌組織來源的一個可靠指標。

GSTP1在肺癌中表達上調，但與肺腺癌患者臨床病理學參數均未見明顯相關性。在非小細胞肺癌、食管癌及胃癌的研究中同樣發現GSTP1表達與臨床病理學參數無明顯相關性［3，17，18］，提示單純檢測GSTP1表達不能作為判斷腫瘤侵襲等生物學行為的預測指標。此外，有限的樣本量很難真實反映結果的客觀性，后期我們將通過增加樣本量并完善病歷資料，進一步明確GSTP1與肺癌患者臨床病理學參數的關系。

本研究結果還發現，GSTP1高表達肺腺癌患者較低表達患者預后不良。胃癌中同樣發現GSTP1高表達組無復發生存率和總生存率均顯著低于低表達組［18］；食管癌中攜帶GSTP1變體Val等位基因患者較未攜帶者預后明顯不良（P=0.045）［17］。此外，卵巢癌多因素分析發現，GSTP1高表達患者無病生存率及總生存率明顯降低（Log-rank：P=0.047，P=0.033）［19］，提示其可以作為評估腫瘤患者預后的1個獨立指標。GSTP1可能通過以下3個方面影響腫瘤患者預后：（1）GSTP1 甲基化：Nelson 等［20］發現，90%以上的前列腺癌及70%前列腺上皮肉瘤發生GSTP1“CpG島”甲基化，GSTP1甲基化致功能的缺乏使正常前列腺上皮細胞易受到各種致瘤性轉化因素的攻擊；（2）GSTP1多態性與腫瘤易感性：GSTP1基因多態性在腫瘤的發生中起重要作用，可引起其表達的相應酶的活性差異，導致解毒功能發生改變，從而增加個體對環境致癌物易感性及患腫瘤的危險［21，22］；（3）腫瘤耐藥性：GSTP1 能催化親電子物質與還原型谷胱甘肽結合，并可與親脂性細胞毒藥物結合增強其水溶性，而促進藥物排泄，降低抗癌藥的作用。此外，GSTP1還能把抗癌藥產生的過氧化物還原，抑制烷化劑類化療藥物引起的癌細胞DNA交聯，最終減低藥物對癌細胞的殺傷作用［14］。

綜上所述，本研究結果表明，GSTP1在肺腺癌中表達上調，并與肺腺癌患者預后相關。

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