白藜蘆醇增加脂肪細(xì)胞3T3-L1中脂聯(lián)素表達(dá)的作用機(jī)制探討

王添，都鎮(zhèn)先，張海燕，鄧娓娓

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.內(nèi)分泌與代謝性疾病科；2.老年病干診科，沈陽(yáng)110001）

脂聯(lián)素，已知的有ACRP30、GBP28和Adipo Q，是在白色脂肪組織中特異性表達(dá)的一種補(bǔ)充因子，可提高脂肪酸氧化及胰島素敏感性［1］。最近研究證實(shí)脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝中起著重要的作用［2，3］。一些研究證實(shí)脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 在脂肪細(xì)胞中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，對(duì)胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用相反［1，4，5］。因此，準(zhǔn)確理解這些脂肪因子的關(guān)系及其調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于提高胰島素相關(guān)代謝性綜合征的治療水平。已有報(bào)道白藜蘆醇能夠拮抗TNF-α抑制脂聯(lián)素的生成［6］，但是這種拮抗機(jī)制仍不清楚，本研究采用白藜蘆醇、TNF-α單獨(dú)或者聯(lián)合作用脂肪細(xì)胞3T3-L1，檢測(cè)脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及釋放、PPAR-γmRNA表達(dá)及活性，為白藜蘆醇防治2型糖尿病及代謝綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究試劑

重組TNF-α購(gòu)于美國(guó)Biosource公司。白藜蘆醇、異丁基甲基黃嘌呤（isobutylmethylxanthine，IBMX）、地塞米松和胰島素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。

1.2 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)和分化

細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM（美國(guó)Invit－rogen公司）中培養(yǎng)，以濃度為1×106/孔在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d。在DMEM中加入IBMX（0.5 mmol/L）、地塞米松（5 μmol/L）和胰島素（10 mg/L）誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)2 d后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液。在含有10%胎牛血清和10 mg/L胰島素的DMEM中再誘導(dǎo)2 d后，用含有10%胎牛血清的DMEM每2 d更換培養(yǎng)液。在誘導(dǎo)分化的12～14 d，細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用原位油紅O染色確定細(xì)胞的分化情況，具體操作按照油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行。超過95%的3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型時(shí)可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 干預(yù)實(shí)驗(yàn)及分組

（1）用白藜蘆醇（0，5，10，20，50 μmol/L）培養(yǎng)分化3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）和脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響；（2） 用 TNF-α（0，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μg/L）培養(yǎng)分化3T3-L1 脂肪細(xì)胞24 h，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組TNF-α對(duì)脂聯(lián)素基因的表達(dá)；（3）在細(xì)胞分化 6～8 d，用白藜蘆醇（0，5，10，20，50 μmol/L）孵育3T3-L1 脂肪細(xì)胞 8 h。然后用或不用 TNF-α（10 ng/mL）孵育24 h，實(shí)時(shí)定量 PCR 法檢測(cè)各組脂聯(lián)素基因的表達(dá)；（4）設(shè)立空白對(duì)照組、TNF-α組和白藜蘆醇+TNF-α組。在分化6～8 d時(shí)，用白藜蘆醇（20 μmol/L）或培養(yǎng)液孵育3T3-L1脂肪細(xì)胞 8 h，然后用 TNF-α（10 μg/L）或培養(yǎng)液孵育24 h，收集各組細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)PPAR-γ基因表達(dá)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR法

收集各組3T3-L1脂肪細(xì)胞，參照說明書，采用異硫氰酸肌法提取總RNA，用12～18的oligo（dT）和super scriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用雙標(biāo)記熒光探針混合物在ABI prism7500自動(dòng)序列分析系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，每組重復(fù)3次。PPAR-γ基因引物特異序列為上游5′-ATGGGTGAAACTCTGGGA-3′和下游5′-TCGGCACTCAATGGCCAT-3′。脂聯(lián)素基因引物特異序列為上游5′-TTGGTCCTAAGGGAG ACATC-3′和下游5′-CAGTGGAGCCATCATAGTGG-3′。β-actin作為內(nèi)參照，其引物特異序列為上游5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′和下游5′-GGAT CTTCATGAGGTAGTCAG-3′。PCR反應(yīng)條件為變性95℃15 s，退火 60℃ 4 min，延伸 60℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)。兩種基因擴(kuò)增結(jié)果用β-actin進(jìn)行標(biāo)化。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

檢測(cè)干預(yù)實(shí)驗(yàn)（1）、（2）、（3）中脂聯(lián)素釋放。收集各組3T3-L1脂肪細(xì)胞的條件培養(yǎng)液。依據(jù)小鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒說明書分析脂聯(lián)素的濃度。每個(gè)濃度用標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)化，并用相對(duì)未處理組百分?jǐn)?shù)來表示。

1.6 提取細(xì)胞核并測(cè)定PPAR-γDNA結(jié)合活性

將干預(yù)實(shí)驗(yàn)⑷各組3T3-L1細(xì)胞顆粒懸于A緩沖液中（10 mmol/L Hepes，pH 7.9，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl和蛋白酶抑制劑的混合物）。測(cè)定PPAR-γ的活性，按照PPAR-γ轉(zhuǎn)錄因子測(cè)定試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.5軟件處理，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和 post hoc Dunnett′s test，以 P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)PPAR-γ在3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)的影響

3T3-L1細(xì)胞系由成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，分化10～12 d后>95%的細(xì)胞呈現(xiàn)出顯著的多囊泡脂質(zhì)沉積（圖1）。脂肪分化的重要標(biāo)志（成熟的脂肪細(xì)胞）是轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ，在成纖維細(xì)胞（0 d）中沒有轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，但是在分化步驟中開始增加［前脂肪細(xì)胞（2 d）、不成熟或者年輕的脂肪細(xì)胞（4～8 d）、成熟的脂肪細(xì)胞（12 d）］。白藜蘆醇增加PPAR-γ表達(dá)呈劑量依賴方式，與對(duì)照組比較，50 μmol/L白藜蘆醇處理組中PPAR-γmRNA水平增加近2倍（表1）。

2.2 白藜蘆醇對(duì)脂聯(lián)素在分化3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)及分泌的影響

為探討白藜蘆醇對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)及分泌的作用，用不同濃度白藜蘆醇處理完全分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h。與對(duì)照組比較，白藜蘆醇在濃度為10～50 μmol/L時(shí)，脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)呈劑量依賴方式增加（P<0.05）；與此相平行，脂聯(lián)素的分泌釋放也呈現(xiàn)劑量依賴方式增加（表1）。

2.3 TNF-α對(duì)脂聯(lián)素在分化3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)及釋放的影響

為了證實(shí)TNF-α對(duì)脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及分泌的作用，不同濃度的重組鼠TNF-α作用于完全分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h。與對(duì)照組比較，從濃度2.5 ng/mL開始，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平成劑量依賴效應(yīng)增加（P<0.01）。與mRNA表達(dá)相平行，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：TNF-α組中脂聯(lián)素分泌的減少也呈現(xiàn)劑量依賴方式（表2）。

2.4 白藜蘆醇對(duì)TNF-α抑制的脂聯(lián)素表達(dá)及分泌的影響

白藜蘆醇顯著拮抗TNF-α誘導(dǎo)的脂聯(lián)素分泌減低，與TNF-α組比較，白藜蘆醇+TNF-α組在白藜蘆醇濃度為20 μmol/L及50 μmol/L時(shí)脂聯(lián)素分泌顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與脂聯(lián)素的分泌模式相平行，在mRNA水平上，白藜蘆醇部分拮抗TNF-α介導(dǎo)的脂聯(lián)素表達(dá)抑制，見表3。這個(gè)結(jié)果提示白藜蘆醇對(duì)脂聯(lián)素分泌的作用源于脂聯(lián)素表達(dá)的調(diào)節(jié)。另外，盡管白藜蘆醇的拮抗作用呈劑量依賴方式，但是最大的抑制效應(yīng)也是部分的。

2.5 白藜蘆醇對(duì)TNF-α誘導(dǎo)PPAR-γmRNA表達(dá)及活性抑制的影響

為了明確白藜蘆醇的調(diào)節(jié)作用是否通過PPAR-γ介導(dǎo)，我們測(cè)定3T3-L1脂肪細(xì)胞細(xì)胞核提取物中PPAR-γDNA結(jié)合活性。結(jié)果顯示：TNF-α顯著抑制PPAR-γ活性，白藜蘆醇拮抗TNF-α抑制PPAR-γ DNA的結(jié)合活性（P<0.01）。用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)PPAR-γmRNA表達(dá)的作用，得到相似的結(jié)果，白藜蘆醇拮抗TNF-α介導(dǎo)的PPAR-γ mRNA抑制（P<0.01），見表4。

3 討論

胰島素抵抗與代謝綜合征（包括2型糖尿病和肥胖）密切相關(guān)。胰島素抵抗的患者及動(dòng)物模型中，脂聯(lián)素血漿濃度和mRNA表達(dá)是下降的［7］。脂聯(lián)素生成調(diào)控的分子機(jī)制尚不十分明確。有報(bào)道證實(shí)，脂肪細(xì)胞中影響胰島素敏感性的一些激素和細(xì)胞因子對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)和分泌有正面或者負(fù)面的影響。例如，噻唑烷二酮是PPAR-γ激動(dòng)劑，可以增加脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素基因的表達(dá)以及循環(huán)中脂聯(lián)素的水平［8］。相反，另外一種可以誘導(dǎo)胰島素抵抗的細(xì)胞因子——TNF-α，作為脂聯(lián)素主要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致代謝紊亂［9］。脂聯(lián)素和TNF-α在脂肪細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)表達(dá)，在胰島素抵抗的調(diào)節(jié)上起著相反的作用［1，4，5］。由于脂聯(lián)素對(duì)胰島素相關(guān)的代謝性疾病的保護(hù)性作用，TNF-α誘導(dǎo)脂聯(lián)素表達(dá)減少可能是胰島素抵抗進(jìn)展的主要事件。

白藜蘆醇是一種自然存在的多酚，在紅酒、藍(lán)莓和花生中的含量較高。盡管已有報(bào)道證實(shí)白藜蘆醇有許多有益的作用，但對(duì)于脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。本研究證實(shí)白藜蘆醇增加脂聯(lián)素在分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá)及分泌；這與陳思凡等［10］報(bào)道的無論胰島素存在與否，白藜蘆醇都可使胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)增加，提示白藜蘆醇可能通過增加脂聯(lián)素的表達(dá)水平來改善胰島素抵抗相一致。但也有報(bào)道［11］證實(shí)白藜蘆醇抑制脂連素mRNA的表達(dá)，在抑制脂肪細(xì)胞分化方面，添加不同劑量的白藜蘆醇可明顯抑制細(xì)胞的分化，減少脂肪的蓄積。導(dǎo)致兩種不同結(jié)論的原因可能與脂肪細(xì)胞分化程度不同有關(guān)。本研究證實(shí)白藜蘆醇增加脂聯(lián)素在分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)及分泌的機(jī)制是白藜蘆醇增加PPAR-γ在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá)；并能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)脂聯(lián)素分泌的下降，脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)與白藜蘆醇誘導(dǎo)脂聯(lián)素的分泌呈平行變化；白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)PPAR-γ活性拮抗TNF-α誘導(dǎo)下調(diào)脂聯(lián)素分泌及mRNA表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道［12］在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型中證實(shí)PPAR-γ激動(dòng)劑通過調(diào)控脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素的表達(dá)，改善胰島素抵抗，但調(diào)節(jié)機(jī)制沒有闡明。本研究可以部分證明白藜蘆醇增加脂連素的表達(dá)是通過增加PPAR-γ活性拮抗TNF-α對(duì)脂聯(lián)素分泌及mRNA表達(dá)的抑制作用來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究提示白藜蘆醇能夠通過調(diào)節(jié)PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄活性繼而拮抗TNF-α誘導(dǎo)下調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)及分泌，這一結(jié)果將有助于設(shè)計(jì)新的治療藥物或治療方法，促進(jìn)胰島素抵抗及2型糖尿病治療手段的發(fā)展。

［1］ Yamauchi T，Kamon J，Waki H，et al.The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity［J］.Nat Med，2001，7（8）：941-946.

［2］Ouchi N，Kobayashi H，Kihara S，et al.Adiponectin stimulates angiogenesis by promoting cross-talk between amp-activated protein kinase and akt signaling in endothelial cells［J］.J Biol Chem，2004，279（2）：1304-1309.

［3］Chen H，Montagnani M，F(xiàn)unahashi T，et al.Adiponectin stimulates production of nitric oxide in vascular endothelial cells［J］.J Biol Chem，2003，278（45）：45021-45026.

［4］Maeda N，Shimomura I，Kishida K，et al.Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/acrp30［J］.Nat Med，2002，8（7）：731-737.

［5］You M，Considine RV，Leone TC，et al.Role of adiponectin in the protective action of dietary saturated fat against alcoholic fatty liver in mice［J］.Hepatology，2005，42（3）：568-577.

［6］Ahn J，Lee H，Kim S，et al.Resveratrol inhibits tnf-alpha-induced changes of adipokines in3t3-l1 adipocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，364（4）：972-977.

［7］Kadowaki T，Yamauchi T.Adiponectin and adiponectin receptors［J］.Endocr Rev，2005，26（3）：439-451.

［8］Yang WS，Jeng CY，Wu TJ，et al.Synthetic peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma agonist，rosiglitazone，increases plasma levels of adiponectin in type2diabetic patients［J］.Diabetes Care，2002，25（2）：376-380.

［9］Cawthorn WP，Sethi JK.Tnf-alpha and adipocyte biology［J］.FEBS Lett，2008，582（1）：117-131.

［10］陳思凡，柯梁汝，鄭琳，等.白藜蘆醇對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的影響［J］.食品科學(xué)，2010，31（23）：285-288.

［11］陳思凡，肖新才，孫延雙，等.白藜蘆醇對(duì)小鼠3T3-L1細(xì)胞增殖與分化的影響及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（1）：108-111.

［12］謝宇，朱亭，劉娟，等.吡格列酮對(duì)肥胖小鼠脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素表達(dá)的影響［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，28（7）：872-875.