絲膠對糖尿病大鼠腎臟ERK信號通路的影響

郝祥俊，于曉敏，宋成軍，王小杰，陳志宏

（承德醫學院1.人體解剖學教研室；2.教務處；3.基礎醫學研究所，河北 承德06 7000）

細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族的一個亞族，可被多種生長因子和細胞因子激活，介導細胞的生長、增殖和分化等。已有研究發現［1，2］，無論是糖尿病模型大鼠還是糖尿病患者，腎臟ERK蛋白的含量及活性均明顯升高；同時，腎臟細胞增生、肥大，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）增多等糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的典型病理改變與ERK信號通路的激活密切相關。

目前，隨著糖尿病發病率的迅速上升，DN的發病率也逐漸升高。臨床上主要用西藥治療糖尿病及其并發癥，但西藥的不良反應不容忽視。絲膠是蠶繭中具有多種生物活性的天然蛋白質，民間有蠶繭泡水降血糖的驗方，本課題組的前期工作［3］已經證明，絲膠可降低糖尿病模型大鼠的血糖，保護糖尿病導致的生殖功能障礙。本研究旨在探討絲膠對糖尿病模型大鼠腎臟ERK信號轉導通路的影響及可能機制，以期為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

48只雄性清潔級SD大鼠，由河北醫科大學實驗動物學部提供（合格證號712024），體質量200～250 g。隨機選取12只作為正常對照組，不作任何處理；余下的36只建立2型糖尿病大鼠模型：2%鏈脲佐菌素（25 mg/kg）連續腹腔注射3 d，成模標準為注射鏈脲佐菌素1周后空腹血糖≥16.7 mmol/L［4］。模型成功建立后36只大鼠隨機均分為糖尿病模型組、絲膠治療組和二甲雙胍組，糖尿病模型組大鼠不再作任何處理，絲膠治療組大鼠灌胃給予絲膠（2.4 g·kg-1·d-1）35 d，二甲雙胍組大鼠灌胃給予二甲雙胍（55.33 mg·kg-1·d-1）35 d。

1.2 藥物與試劑

絲膠由彩色蠶繭（由承德醫學院蠶業研究所提供）經浸泡、水煎、過濾、濃縮而成；鹽酸二甲雙胍（國藥準字H21024375，遼寧一成藥業有限公司）臨用時用蒸餾水配成溶液。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）用枸櫞酸鈉—枸櫞酸緩沖液（pH=4.4）配成2%的溶液。檢測血糖試劑盒（保定長城臨床試劑有限公司）、BCA蛋白定量試劑盒（北京泰格美科技有限公司），兔抗pERK1/2抗體、兔抗絲裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）1/2抗體、兔抗c-fos抗體（北京博奧森生物技術有限公司），小鼠抗β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、山羊抗兔、小鼠IgG（美國KPL公司），ERK、MEK、c-fos引物由上海生工生物工程有限公司合成，Trizol（美國Invitrogen公司）、一步法RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.3 檢測血液指標

4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經內眥于眶后靜脈叢采血后離心（3000 r/min，20 min），取血清-20℃保存。采用葡萄糖氧化酶法、使用Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動臨床生化分析儀檢測血糖。

1.4 腎臟ERK信號通路相關因子表達的檢測

大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.4.1 Western blot法檢測各組大鼠腎臟 ERK、MEK、c-Fos蛋白的表達：取液氮保存腎臟100 mg提取蛋白，加入蛋白裂解液冰上裂解腎臟組織，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。蛋白上樣量80 μg，15%SDS-PAGE凝膠電泳、PDVF膜轉膜；封閉后加入一抗［β-actin（1∶1000）、MEK1/2（1∶100）、pERK1/2（1∶100）、c-fos（1∶100）］，4 ℃孵育過夜；加入 HRP標記的二抗（1∶5000），室溫搖床孵育1 h，Super ECL Plus超敏發光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件分析膠片掃描后的顯影條帶，以目的條帶和βactin條帶的灰度比值作為ERK、MEK、c-Fos蛋白的相對表達水平。

1.4.2 RT-PCR法檢測各組大鼠腎臟ERK、MEK、cfosmRNA的表達：取液氮保存腎臟（100 mg），按Trizol試劑說明提取腎臟的總RNA，并反轉錄成cDNA，產物進行PCR。PCR引物序列、擴增條件及產物長度見表1。PCR反應體系50 μL，PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸1 min，第2步起循環。取5 μL擴增產物及5 μL的DNA Ladder行2%瓊脂糖凝膠電泳（90 V，40 min），ZF 型紫外透射反射分析儀攝像，Quantity One-4.6.2軟件進行分析，以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值，作為ERK、MEK、c-fosmRNA的相對表達水平。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖結果

與正常對照組大鼠血糖［（10.83±2.03）mmol·L-1］比較，糖尿病模型大鼠的血糖［（29.45±4.82）mmol·L-1］明顯升高（P＜0.01）；與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組 ［（13.20±4.09）mmol·L-1］、二甲雙胍組［（13.18±2.30）mmol·L-1］大鼠的血糖明顯降低（P ＜0.01）。

2.2 各組大鼠腎臟ERK的表達

如圖1、表2所示，糖尿病模型組大鼠腎臟pERK蛋白及mRNA的表達較正常對照組大鼠高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟ERK的表達，絲膠治療組、二甲雙胍組大鼠腎臟pERK蛋白及mRNA的表達明顯較糖尿病模型組大鼠低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎臟MEK的表達

糖尿病模型組大鼠腎臟MEK蛋白及mRNA的表達較正常對照組大鼠高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟MEK的表達，絲膠治療組與二甲雙胍組大鼠腎臟MEK蛋白及mRNA的表達較糖尿病模型組大鼠低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖2和表3。

2.3 各組大鼠腎臟c-fos的表達

糖尿病模型組大鼠腎臟c-fos蛋白及mRNA的表達較正常對照組大鼠高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟c-fos的表達，絲膠治療組、二甲雙胍組大鼠腎臟c-fos蛋白及mRNA的表達較糖尿病模型組大鼠低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖3和表4。

3 討論

腎小球系膜增殖是DN早期的病理特征之一，也是晚期腎臟硬化的前驅表現之一［5，6］。DN時，腎小球系膜細胞是多種致病因子作用的主要靶細胞，同時系膜細胞又可合成和分泌多種細胞因子，這些細胞因子又在DN的進展中發揮了重要作用［7，8］。細胞因子對細胞行為的調節與細胞內多種信號轉導通路的活化密切相關，其中，ERK信號通路是糖尿病發病過程中不同信號通路的交匯點［9］。

本研究發現，糖尿病模型大鼠腎臟ERK及其上游基因MEK1/2、下游基因c-fos的表達均明顯上調，ERK信號通路處于活化狀態。高血糖、腎素—血管緊張素系統激活、系膜細胞內氧化應激產物增多、血流動力學異常、內皮素、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）及血小板衍生生長因子等均可使ERK信號通路活化［10，11］。高血糖激活ERK通路可能與高糖的直接作用或高糖通過促進非酶促糖基化反應、多元醇代謝通路活化和氧化應激加強等有關。Tian等［12］的研究發現，增高的血糖可經糖酵解途徑使二脂酰甘油合成增加，從而激活蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）；PKC 作為 Raf/MEK/ERK通路的上游激酶，導致ERK活化。因此，糖尿病時ERK通路激活被認為是DN發生發展過程中一個重要的分子機制，但具體的激活機制尚不完全清楚［9］。

ECM積聚是DN的一個顯著特征。ERK信號通路活化后可激活下游多種轉錄因子，通過促進系膜基質增生參與ECM的積聚，從而促進DN的發生發展［13］。如 ERK 通路活化后通過激活 TGF-β1、磷酸化絲氨酸178位點使p27活化（Kip1）、增加c-fos和c-jun等基因的表達，誘導腎小球系膜細胞增殖、肥大，ECM合成增加、降解減少，導致ECM的進行性積聚［14，15］；另外，TGF-β1等細胞因子還可間接激活ERK 信號通路，從而形成惡性循環［1，2］。

糖尿病屬中醫學“消渴癥”的范疇，治療原則是生精清熱、潤燥養陰。蠶繭是蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，可滋陰潤燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。起源于中國的蠶絲業擁有幾千年的悠久歷史，但對蠶絲的應用主要集中于絲素，約占繭絲30%的絲膠遭到丟棄。學者們一直在探討如何有效利用如此大量優質的蛋白質，并發現了絲膠許多新的功效，如美容、護膚、營養、抗氧化、抗癌等［16，17］。民間早有蠶繭泡水控制血糖的驗方，本課題組的前期研究也證實了這一點［3］。本研究發現，絲膠治療組大鼠腎臟MEK、ERK1/2及c-fos的表達明顯低于糖尿病模型組大鼠，表明絲膠可通過下調ERK及其上游、下游基因的表達，抑制ERK信號通路的激活，減輕ERK信號通路介導的腎小球系膜細胞增生肥大，ECM合成增加、ECM進行性積聚以及細胞增殖等腎臟損傷，具有阻止糖尿病時腎臟損害的作用。同時，由于絲膠是天然的蛋白質，具有生物相容性，可生物降解，對人體無毒性，可避免化學合成藥物帶給人體的不良反應，因此具有良好的應用推廣前景，但相關機制有待進一步研究與探討。

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