火炮打擊兔應激防護模型腸組織病理及NMDAr1表達的形態學研究

劉勝利 張建華 俞雄杰 周 龍 林進皇 余 海 郁毅剛▲

1.解放軍第一七五醫院暨廈門大學附屬東南醫院神經外科，福建漳州 363000；2.解放軍73131部隊，福建漳州 363000

在現代戰爭中，火炮打擊帶來的爆震性損傷，仍是部隊減員最為重要的原因之一。而火炮打擊后，除可見的肢體損傷外，由此引起的應激炎癥反應綜合征，對有生力量戰斗力的影響不可忽視。本實驗探討了在模擬實戰情況下火炮打擊后，爆震傷引起的兔的應激炎癥反應綜合征的情況，在之前筆者分別探討了卵巢、血清自由基等組織器官對于應激反應的病理及免疫組織化學的形態學變化[1-2]。本實驗主要探討腸組織病理改變及免疫組織化學中的NMDAr1（N-methyl-D-asparate receptor-1，NMDAr1）受體在腸應激反應中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及動物

團進攻炮火覆蓋火力類型：武裝直升機火箭彈、XX自行榴彈炮、XX牽引加農炮、XX自行火箭炮、水陸兩棲坦克、XX輪式突擊炮、XX迫擊炮、XX反坦克導彈。健康成年日本大耳白兔30只，雌雄不拘，清潔級，體質量2.5～3.0 kg（廈門大學醫學院動物中心提供）；按照隨機表法分為3組，空白對照組6只、反角隱蔽組6只、迎面隱蔽組18只（距離攻擊目標10 m隱蔽組6只，20 m隱蔽組6只，30 m組隱蔽6只）。

1.2 實驗方法

按照文獻方法設計實驗[1]，實驗時間和環境條件為南方秋季中午山地環境，環境溫度16～28℃，濕度為43%～65%。實驗兔常規喂養，演習當日凌晨運至目標高地，炮靶前迎面10、20、30 m處挖掘約1 m深掩體，各放置實驗兔6只，上覆蓋硬質木板、松枝，留通氣道。炮靶后反角10 m處挖掘同樣掩體，放置實驗兔6只。空白對照組于炮靶陣地外10 km營區喂養。中午演習開始，全過程2 h。轟炸機俯沖（未投彈），持續火炮急襲5 min。各型火炮、坦克、導彈、武裝直升機集群連續發彈若干，期間暫停2次，各10 min。演習結束，工兵排爆清理陣地后進場取回實驗兔。傷后6 h處死存活兔解剖，取腸組織標本，4%甲醛固定。

1.3 腸組織病理檢測

取4%甲醛固定腸組織，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察形態學變化，由同一病理醫師采用盲法評價。觀察腸組織結構層次是否完整，腸組織細胞腫脹、變性、壞死，間質出血、水腫等情況。

1.4 腸組織NMDAr1免疫組織化學表達的測定

取4%甲醛固定腸組織，石蠟包埋，連續切片（4μm），每例標本切5張免疫組織化學染色用。采用改進型SP法進行免疫組織化學染色，嚴格參照試劑盒說明操作。試劑盒型號，購于XX公司。每次染色時均用已知陽性切片作陽性對照，用PBS（磷酸緩沖液，0.01 mol/L，pH 值 7.2）代替一抗作陰性對照。NMDAr1表達均位于胞質和胞核內，表現為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評估其染色，無陽性細胞數為（-），陽性細胞數＜25%為（+），25%～50%為（++），51%～75%為（+++），＞75%為（++++）。

2 結果

2.1 各組實驗兔的一般情況

各組實驗兔均無直接火力命中。與空白對照組比較，反角隱蔽組實驗兔全部存活，部分精神萎靡、反應遲鈍、伏地，少部分耳道出血。因彈著點不規律，迎面隱蔽3組距離無差異，合并為一組。迎面隱蔽組18只實驗兔當場死亡9只，至傷后6 h取腸組織標本前再死亡3只，死亡率達66.7%（12/18）。剩余6只存活實驗兔編為迎面隱蔽組，與另外兩組同時刻點取腸組織進行病理形態學及免疫組織化學檢測，每只取5張切片進行免疫組織化學表達強度及形態學觀察研究。

2.2 腸組織HE染色結果

空白對照組腸組織切片HE染色顯示，腸黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層完整，結構均勻致密。環形皺壁表面存在多量不規則形狀柱狀絨毛，其間上皮及固有層完整。上皮間混雜杯狀細胞。絨毛中心為結締組織，可見黏膜下神經叢。絨毛基底可見潘氏細胞和肌間神經叢分布，肌漿深染，膠質豐富，可見散在分布血管，腔內少量紅細胞，未見明顯炎癥細胞（圖1、圖2）。反角隱蔽組腸組織切片HE染色顯示，分層結構存在。柱狀絨毛上皮頂部變性壞死，局部脫落，上皮細胞胞質空泡變性；細胞間少量紅細胞，炎癥細胞浸潤（圖3、圖4）。迎面隱蔽組腸組織切片HE染色顯示，細胞結構層紊亂，分界不清，部分壞死，崩解；細胞數明顯減少，黏膜層及下層和肌層分離；可見散在紅細胞分布，漿細胞浸潤（圖 5、圖 6）。

2.3 腸組織NMDAr1免疫組織化學的表達

空白對照組見柱狀絨毛完整，絨毛中心固有層可見分布NMDAr1表達陽性神經叢棕染，NMDAr1蛋白少量表達（+）（圖7、圖 8）；反角隱蔽組可見絨毛腫脹，固有層變性，細胞減少，黏膜上皮細胞中神經叢廣泛棕染（++），NMDAr1中量表達（圖9、圖10）；迎面隱蔽組，可見絨毛壞死崩解，全部胞質、胞膜均棕染，色深。NMDAr1大量表達（++++）（圖11、圖12）。迎面隱蔽組、反角隱蔽組NMDAr1免疫反應強度均高于對照組，迎面隱蔽組NMDAr1免疫反應強度亦高于反角隱蔽組。

2.4 NMDAr1表達與組織病理的關系

通過3個實驗組的觀察，空白對照組、反角隱蔽組與迎面隱蔽組NMDAr1免疫組織化學的表達量逐漸遞增，腸的病理改變也由可逆的變性加重為不可逆的壞死（表1）。

表1 NMDAr1表達與組織病理的關系

3 討論

在火炮打擊后，對比空白對照組、反角隱蔽組及迎面隱蔽組3組的生存率，發現反角掩體兔的存活率為100.0%（18/18），而迎面隱蔽組死亡率高達 66.7%（12/18），其有力地說明戰地反角隱蔽可有效保證在密集火炮打擊下生存。同時，也可說明迎面角投彈可有效消滅敵軍。此外，如何減輕有生力量對炮擊帶來的爆震、彈片、噪聲、應激、精神損傷等復合性損傷，保障有生力量的戰斗力也極為重要。目前研究表明[3-6]，加強日常訓練，模擬戰場環境訓練，綜合衛生心理訓練，改善機體營養狀況及傷后心理護理，均可提高機體應激適應能力。

眾所周知，應激反應是把“雙刃劍”，一般情況下的應激反應是對人有利的，但長時間過于強烈的應激反應會給人帶來損傷。臨床上因重型損傷導致的應激性消化潰瘍較為常見。目前研究表明，腸的應激性損傷主要與腦-腸軸相關，而較早所認知的下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統（HPA軸），內臟高敏效應、精神心理等因素可能僅是其在胃腸道應激作用中的具體表現[7-10]。胃腸道直接或間接的受中樞神經系統、自主神經系統的共同支配[11-12]，并通過共同的遞質——腦腸肽，建立起腦-腸軸調節的通路。已證實的腦腸肽包括組胺、5-羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、去甲腎上腺素（NE）、神經降壓素（NT）、P 物質（SP）、降鈣素相關肽（CGRP）、血管活性腸肽（VIP）等[13]。這些物質通過直接或間接影響胃腸平滑肌蠕動、血管的收縮、腺體的分泌實現對胃腸道的作用。較為深入地研究腦-腸軸的關系，明確腦腸肽在導致腸應激損傷通路中的節點，可確定藥物治療的新靶點，為探索新的預防與治療方法提供思路。

NMDAr1是一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體，主要分布于大腦皮質、丘腦、紋狀體、海馬等的突出后膜上，此外其在脊髓背角運動神經元軸突中也有分布，并延伸到內臟神經末梢。目前研究表明，其與應激反應主要的通路HPA軸有著密切的關系[14]。本實驗結果顯示，隨著兔的腸應激性病理改變的加重，NMDAr1在腸內的免疫組織化學表達量逐步增加。而Varga G等[15]研究證實，通過抑制NMDAr1受體可降低腸炎模型小鼠的炎癥反應，表明NMDAr1參與了爆炸及爆炸應激狀態下腸組織病理損傷過程。其可能的作用機制有以下幾個方面：①中樞的NMDAr1通過激活HPA軸促進腎上腺皮質激素的分泌和釋放，介導炎癥應激反應[16]。葉建寧等[17]通過測定嚴重燙傷小鼠海馬NMDAr1受體的表達研究認為，NMDAr1減弱了腎上腺皮質激素的負反饋調節，從而引起腎上腺皮質激素大量分泌。②NMDAr1通過降低胃黏膜VCL的表達，導致胃黏膜組織屏障發生變化，使胃酸、胃蛋白酶等更容易破壞黏膜的完整性[18]。③外周NMDAr1受體增強外周高敏化[19]，Du J等[20]應用電生理學單纖維記錄方法發現正常狀態下給予NMDAr1可以誘發27%左右的C纖維放電，而在足底注射CFA后，NMDAr1誘發C纖維放電的概率（86%）和頻率顯著增加，并且誘發傷害性感受器放電所需的NMDAr1閾值濃度也較正常狀態明顯下降。痛閥的降低使應激變的更加敏感，應激的強度相應增高。④外周NMDAr1受體增強了神經遞質的釋放。在炎癥和損傷情況下，外周傷害性感受器持續受到刺激，導致中樞終末釋放的神經遞質增多，引起脊髓背角突觸后神經元超興奮，該神經元將超興奮的信息繼續向上傳遞到腦中樞從而產生慢性痛[21]。持續的慢性疼痛導致應激反應持續時間增長，炎癥加重。

通過本實驗結果可以清晰觀察到，兔的腸病理結構改變由輕到重時，NMDAr1的表達量也由（+）增加至（++++），這也佐證了目前對于NMDAr1的研究，NMDAr1在低水平量時，其介導的應激反應，起到自我保護作用，當其超過保護機制的臨界點時，將損傷機體。由此，一旦確定NMDAr1損傷機體的扳機點，將有可能在其介導炎癥前，采取阻斷措施，從而減輕對機體的損傷。可見今后對于NMDAr1介導炎癥通路及其扳機點的探討，或者針對更加廣泛的全身應激反應綜合征的多通路、多指標的探討，對于預防治療應激性病變將產生不可估量的作用。

[1]林也容，張建華，郁毅剛，等.山地團進攻制式火炮打擊兔應激防護模型血清自由基變化實驗研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2012，11（15）：1167-1169.

[2]林也容，張蘭，李娟，等.火炮打擊兔應激防護模型卵巢病理及P38表達的形態學研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2013，12（18）：1437-1439.

[3]王新興，錢令嘉，冷雪，等.不同訓練強度士兵的應激適應能力[J].解放軍預防醫學雜志，2004，22（3）：171-173.

[4]李敏，李彥章，黃梅園，等.軍事演習應激對野戰部隊官兵心理和情緒的影響[J].第三軍醫大學學報，2007，29（19）：1894-1895.

[5]趙秋玲，楊全峰，李曉明.急進駐高原官兵胃腸道應激反應的營養干預研究[J].臨床軍醫雜志，2011，39（6）：1147-1149.

[6]甘元瓊.心理護理在當代護理工作中的運用和作用[J].中國當代醫藥，2009，16（15）：117-119.

[7]TachéY，Perdue MH.Role of peripheral CRF signalling pathways instress-related alterations of gut motility and mucosal function[J].Neurogastroenterol Motil，2004，16（1）：137-142.

[8]Stengel A，TachéY.Corticotropin-releasing factor signaling and visceral response to stress[J].Exp Biol Med （Maywood），2010，235（10）：1168-1178．

[9]王敬東.腦-腸互動在腸易激綜合征發病中的作用[J].世界華人消化雜志，2006，14（34）：3299-3301.

[10]李寧寧，方秀才.腦-腸軸在腸易激綜合征發病中的作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2013，22（2）163-166.

[11]Giaroni C，Zanetti E，Chiaravalli AM，et al.Evidence for a glutamatergic modulation of the cholinergic function in the human enteric nervous system via NMDA receptors[J].Eur J Pharmacol，2003，476（1-2）：63-69.

[12]Liu MT，Rothstein JD，Gershon MD，et al.Glutamatergic enteric neurons[J].JNeurosci，1997，17（12）：4764-4784.

[13]Varga G，Balint A，Burghardt B，et al.Involvement of endogenous CCK and CCK1 receptors incolonic motor function[J].Br J Pharmacol，2004，141（8）：1275-1284.

[14]陸建華，黎海蒂，高京生.燙傷大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型基因表達的變化[J].中華燒傷雜志，2002，18（3）：180-182.

[15]Varga G，魪rces D，Fazekas B，et al.N-Methyl-D-aspartate receptor antagonism decreases motility and inflammatory activation in the early phase of acute experimental colitis in the rat[J].Neurogastroenterol Motil，2010，22（2）：217-225.

[16]張慶宇，房明.應激反應中腎上腺激素的作用[J].中國當代醫藥，2009，16（8）：184-185.

[17]葉建寧，陸建華，熊加祥.海馬NMDAr1受體調節嚴重燙傷應激后HPA軸興奮性的相關機制研究[J].中華神經醫學雜志，2006，5（10）：982-985.

[18]高會軍，黃裕新，王勝智，等.應激對大鼠胃粘膜VCL和海馬NMDAr1R2 表達的影響[J].山西醫科大學學報，2012，43（10）：727-803.

[19]Gaudreau GA，Plourde V.Involvement of N-methyl-d-aspartate（NMDA） receptors in a rat model of visceral hypersensitivity[J].Behav Brain Res，2004，150（1-2）：185-189.

[20]Du J，Zhou S，Coggeshall RE，et al.N-methyl-D-aspartate-induced excitation and sensitization of normal and inflamed nociceptors[J].Neuroscience，2003，118（2）：547-562．

[21]Woolf CJ，Salter MW.Neuronal plasticity：increasing the gain in pain[J].Science，2000，288（5472）：1765-1769.