慢性乙型肝炎中醫證型與HBV特異性CTL應答相關性研究

陳德良 ，王少揚，黃德東，陳 劍

（1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.南京軍區福州總院，福建 福州 350025）

乙型肝炎病毒（HBV）特異性CD8+T細胞（CTL）介導的細胞免疫應答在控制HBV感染和病毒清除中至關重要，而辨證分型是中醫治療慢性乙型肝炎（CHB）的基礎，慢乙肝不同中醫證型與特異性CTL應答之間可能存在一定相關性。本研究通過對中醫辨證分型為濕熱中阻型和肝郁脾虛型CHB患者的PBMC在體外經特異性抗原和混合肽段誘導下CTL應答效應的觀察，探討HBcAg、HBsAg、混合肽段對其CTL細胞應答的影響，為慢性乙型肝炎免疫治療及中醫辨證分型提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要抗體及試劑 人重組 HBcAg、HBsAg、混合肽段（HBcAg18－27，5′-FLPSDFFPSV-3′；HBcAg60－68，5′-VCWGELMNL-3′；HBsAg183-191，5′-FLLTRILTI-3′）及植物血凝素（PHA）購于上海寶曼生物科技有限公司；人IFN-γ ELISPOT試劑盒及相關產品及人淋巴細胞分離液（Ficoll-PaqueTM PLUS）購自美國Sigma公司。

1.2 一般資料 選擇2012年3月—2013年3月南京軍區福州總院感染科病房及門診CHB濕熱中阻型和肝郁脾虛型患者各30例。西醫診斷標準參照2005年12月10日頒布的 《慢性乙型肝炎防治指南》［1］，中醫診斷標準參照1991年天津會議制定的《病毒性肝炎中醫辨證標準》［2］。排除既往進行過抗病毒治療及HAV、HEV、HCV等病毒感染和其他原因（藥物、酒精、中毒）造成的急慢性肝損害患者。2組患者在性別、年齡、病程等方面比較經統計學檢驗，無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 2組一般資料比較（）

表1 2組一般資料比較（）

組 別濕熱中阻組肝郁脾虛組男21 20 n 30 30女91 0年齡／歲27.47±6.40 29.40±6.93病程／a 9.63±4.52 10.40±4.40

1.3 生化、乙肝血清標志物及HBVDNA定量檢測肝腎功能采用全自動生化儀檢測，乙肝血清標志物采用酶聯免疫法，HBVDNA檢測采用熒光定量PCR法檢測。以上檢測均在我院檢驗科完成。

1.4 人外周單個核細胞（PBMC）的分離和細胞因子IFN-γ ELISPOT檢測 無菌采靜脈血10 mL，用泛影葡胺密度梯度法分離PBMC，并用RPMI 1640完全培養液將細胞濃度調至1×106個／mL，按照ELISPOT試劑盒的說明書操作。先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養基封閉ELISPOT預包被板1 h，臨用前倒掉封閉液，加入1×106個／mL人的PBMC（直接用新鮮的PBMC）100 μL。CHB肝郁脾虛和濕熱中阻組加入 20 μg／mL 的混合肽段、HBcAg、HBsAg 各 100 μL 誘導，陽性參照組加入 4 μg／mL 的 PHA 100 μL進行誘導，在細胞培養箱內培養26～36 h后，在每孔中加入100 μL預冷的去離子水，并在4℃下放置10 min，倒掉液體，用洗滌液洗滌5～7次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水紙上扣干。然后向每孔中加入生物素標記的anti-IFN-γ單抗，37℃孵育1 h，倒掉液體，用洗滌液洗滌5次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水紙上扣干。加入檢測二抗，在37℃孵育1 h，倒掉液體，用洗滌液洗滌5次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水紙上扣干。最后加入顯色劑顯色15～30 min，待出現斑點后立即用自來水沖洗終止反應。ELISPOT板晾干后用斑點讀板儀計數，并記錄斑點數，計算IFN-γ數量以SFC／105PBMC表示，做統計學分析。

1.4 統計學處理 采用SPASS16.0進行數據統計分析，兩樣本均數比較用t檢驗，多個標本均數比較用方差分析。

2 結 果

2組PBMC經HBcAg、HBsAg、混合肽段誘導產生IFN-γ數量比較 見表2。

表2 2組PBMC經不同誘導物誘導產生IFN-γ 數量比較（）SFC／105PBMC

表2 2組PBMC經不同誘導物誘導產生IFN-γ 數量比較（）SFC／105PBMC

注：與肝郁脾虛組比較，1） P＜0.05；與 HBsAg比較，2） P＜0.05；與混合肽段比較，3） P＜0.05。

HBcAg 37.60±2.561）2）3）31.27±2.032）3）組 別濕熱中阻組肝郁脾虛組HBsAg 14.33±1.261）10.37±1.47 n 30 30混合肽段14.17±1.621）10.57±1.94

3 討 論

慢性乙型肝炎是嚴重影響我國人民健康的傳染病，是導致肝硬化肝癌的主要原因。據估計目前我國有乙肝病毒攜帶者9千萬人以上，有2千萬以上慢性活動性肝炎患者需要治療。現國內外公認的乙肝抗病毒治療措施主要是干擾素和核苷（酸）類藥物，前者有效率僅在40%左右，并存在明顯毒副作用；后者雖然有明顯的抗病毒作用，但存在耐藥和停藥后復發的局限性，故探尋更有效的治療措施十分必要。HBV特異性CTL應答效應已有大量試驗證明是HBV感染后慢性化和病情發展的關鍵因素。在急性自限性HBV感染者多表現為強的多克隆的HBV特異性CTL應答效應，相反在慢性乙肝患者多表現弱的寡克隆的HBV特異性CTL應答效應，甚至部分患者缺失［3］，通過調節HBV特異性CTL應答是治療慢性乙型肝炎主要途徑。中醫中藥在調理人體免疫功能方面有獨到的優勢，而中醫辨證分型又是中醫診斷和治療疾病的基礎，所以探討慢性乙型肝炎的中醫辨證分型與HBV特異性CTL應答效應相關性，有可能找到中西醫結合治療慢性乙型肝炎的切入點。本實驗共收集慢性乙型肝炎中醫辨證分型為濕熱中阻型和肝郁脾虛型各30例，通過對不同抗原和混合肽段的觀察，乙肝核心抗原作為最強的抗原可誘導較明顯的HBV特異性CTL應答，在不同的抗原誘導下濕熱中阻型和肝郁脾虛型相比，前者表現出較明顯的HBV特異性CTL應答效應。以上結果提示：如果通過合理的有效的中西醫結合免疫調節治療，濕熱中阻型慢性乙肝患者可能會取得明顯的療效而肝郁脾虛型患者還需要更強的免疫調控措施打破已存在的免疫耐受。國內部分學者通過不同指標檢測或者不同的辨證分型就慢性乙肝免疫狀態與辨證分型相關性也進行了探討，如王見義等［4］就慢性乙肝濕熱中阻型、肝腎陽虛和肝腎陰虛型中CD8+T細胞和CD4+／CD8+比值進行比較，結果3型CD8+細胞計數逐漸降低而CD4+／CD8+比值逐漸升高，提示不同中醫證型間存在免疫學差異。馮建英等［5］就慢性乙型肝炎的虛證和實證與CTL應答效應也做了分析，提示實證CTL應答效應高于虛證，但低于健康對照組。我們按國內公認的中醫辨證分型進行分型入組，并選擇相對常見的2型作為研究對象，就不同抗原誘導CTL效應進行觀察，為今后選擇更有效的免疫誘導劑打下理論基礎。當然中醫辨證目前還存在不同分型方法，CTL應答效應特別是特異性CTL應答效應的檢測方法還需要進一步改進和完善。

［1］中華醫學會肝病學分會、感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南［S］.實用肝臟病雜志，2006，9（1）：8-18.

［2］中國中醫藥學會內科肝病專業委員會第四次學術會議.病毒性肝炎中醫辨證標準［S］.中醫雜志，1992，33（5）：39—40.

［3］閆杰，謝雯，馮鑫，等.HBcAg特異性CTL在急性乙型肝炎與慢性乙型肝炎急性發作患者外周血中的數量差異［J］.世界華人消化雜志，2011，19（4）：404-406.

［4］王見義，韓向暉，王靈臺，等.慢性乙型肝炎中醫證型與免疫功能的相關性研究［J］.上海中醫藥雜志，2007，41（9）：35-36.

［5］馮建英，邵建國，陳琳，等.慢性乙型肝炎中醫虛實辨證與機體特異性細胞免疫及病毒復制的關系探討［J］.遼寧中醫藥大學學報，2013，15（8）：136-138.