痛風寧顆粒對急性痛風性關節炎模型大鼠關節局部炎證因子及TLRs／MyD88的影響

周必洪，傅玉輝，閆 虎，陳寶軍，張慶，張子怡，王藝如，蘇友新

（福建中醫藥大學，福建 福州 350122）

課題組前期研究［1-4］發現痛風寧顆粒具有較好抗炎、消腫、鎮痛等作用，能有效控制急性痛風性關節炎的癥狀，但其具體作用環節尚不明確。近年來研究表明：急性痛風性關節炎的發病可能與關節滑膜TLR-2、4、MyD88 mRNA的高表達、關節滑液中 TNF-α、IL-1β的增多及大量中性粒細胞進入關節腔有關。課題組擬以急性痛風性關節炎大鼠為模型，觀察痛風寧顆粒對模型大鼠關節滑液TNF-α、IL-1β含量及滑膜組織中TLR-2、4，MyD88 mRNA表達的影響，以進一步闡明痛風寧顆粒抗炎、鎮痛作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只SPF級健康雄性SD大鼠，體重（200±15）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供［實驗動物許可證號：SCXK（滬）2007-0005，合格證號：0073141］，委托福建中醫藥大學實驗動物中心購買和飼養。

1.2 主要試劑及藥物 白細胞介素-1β（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（北京普爾偉業生物科技有限公司，批號：20091225、2009122）；微晶型尿酸鈉（Sigma-aldrich 公司，批號：108K5309）；逆轉錄試劑盒、PCR Master Mix（Fermentas公司，批號：K1622、K0171）；100bp Ladder（百泰克公司，批號：PR3001）；痛風寧顆粒：每克含生藥3.2 g（福州辰星藥業有限公司提供，中試產品批號：101024）；秋水仙堿：0.5 mg／片（云南省玉溪望子龍生物制藥有限公司，批號：20090702）。

1.3 主要設備 PYX-DHS恒溫箱（上海躍進醫療器械廠）；CUT4060石蠟切片機（德國Leica公司）；BH-2光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；101A-2真空干燥箱（上海實驗儀器總廠）；PE9600基因擴增儀（香港PERKIN ELMER公司）；梯度PCR儀（英國GENE TECHNOLOGIES 公司）；FJ2008PS γ 放射免疫計數器（西安二六二廠）；Allegra 64R低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥品制備

1.4.1.1 尿酸鈉溶液的制備 電子天平稱取尿酸鈉晶體2.5 g，高溫高壓后，加入無菌生理鹽水至100 mL，制成 25 mg／mL的尿酸鈉懸濁液，4℃保存，用前搖勻。

1.4.1.2 干預藥物制備 成人（60 kg）每日痛風寧顆粒、秋水仙堿常用量分別為27 g、3 mg，根據人與大鼠用量關系［5］換算得出大鼠每日以上2種干預藥物的用量分別為 2.93 g／kg、0.325 mg／kg。 依據上述用藥量計算出每只大鼠的用藥量，加入2 mL蒸餾水溶解，制成混懸液，4℃保存，用前搖勻。

1.4.2 動物分組及造模 用隨機數字表法把適應性喂養1周后的36只SPF級健康雄性SD大鼠分成正常組、模型組、痛風寧顆粒組、秋水仙堿組共4組。參照Coderre造模方法［6］，固定板固定大鼠，以右膝關節為中心，常規消毒，以右膝外側膝眼為進針點，向每個正常組大鼠關節腔內注射0.2 mL生理鹽水，其余3組大鼠以同樣的方法分別注入0.2 mL 2.5%尿酸鈉懸濁液。

1.4.3 藥物干預 造模1 h后，痛風寧顆粒組、秋水仙堿組大鼠根據體重分別使用相應藥物混懸液2 mL灌胃，正常組、模型組大鼠分別以2 mL生理鹽水灌胃，每日1次，連續3 d。

1.4.4 標本采集 末次灌胃1 h后，各組實驗大鼠分別用10%水合氯醛以300 mg／kg的劑量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，以大鼠右膝關節為中心，常規備皮、消毒、鋪巾，戴無菌手套，切開右膝關節囊，關節腔用1 mL生理鹽水沖洗，收集沖洗液，取1滴于載玻片上涂片，福爾馬林溶液固定；切取關節囊，固定于4%中性甲醛固定液。

1.4.5 關節液HE染色光鏡下中性粒細胞計數 將固定的載玻片進行HE染色，嚴格按HE染色試劑盒步驟操作，400倍光鏡下取5個隨機視野進行中性粒細胞計數，取均值。

1.4.6 滑膜組織HE染色光鏡下觀察 取出固定于4%中性甲醛液中的關節囊，沖洗后常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成蠟塊后，切片、脫蠟、復水、HE染色，光鏡下觀察形態學的變化。

1.4.7 關節液細胞因子TNF-α、IL-1β檢測 嚴格按照放射免疫試劑盒步驟操作，檢測各組大鼠關節沖洗液中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.8 滑膜組織中TLR-2、4及MyD88 mRNA的表達檢測 ① 總RNA的提取：采用Trizol法提取大鼠膝關節滑膜組織細胞總RNA，嚴格按照試劑盒步驟操作。②RNA純度及完整性檢測：取2 μL總RNA稀釋50倍后加入紫外分光光度計中，測定樣品在260 nm和280 nm的吸光值，計算出OD 260／OD 280值， 按 1 OD＝40 μg／mL RNA 計算 RNA 的純度。③cDNA的制備：在PCR管中配制反應體系，1 μg RNA的體積根據所得的OD值計算得出，用無RNA酶的水調整體系至20 μL；在PCR儀上設置反應條件，30℃ 5 min、42℃ 60 min、95℃ 5 min、70℃ 5 min，反應結束后保存于-20℃冰箱。④RT-PCR反應：引物的設計，由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成Pubmed上檢索的TLR-2、4及MyD88完整外顯子序列（見表1）；反應體系的配置：在RT-PCR反應專用八聯管中進行，每個樣本重復3個復孔，并做一個陰性對照；反應條件，94℃ 3 min、94℃ 30 s、X℃30 s（TLR255℃、TLR455℃、MyD8855℃）、72℃ 30 s、35個循環，72℃ 10 min，4℃ 保存。 在GS-1 PCR儀工作程序上設定三步法檢測。

表1 引物設計

2 結 果

2.1 模型鑒定 造模前正常組、模型組、痛風寧顆粒組大鼠皮毛光澤色白，活潑好動，飲食正常；造模1 h后，除空白組外，其余3組大鼠均出現關節紅腫，局部皮膚溫度升高，活動減少，舔足，飲食量減少等現象。圖1、表2顯示除正常組外，其余各組大鼠關節液中性粒細胞數均升高，模型組較正常組有非常顯著性差異（P＜0.01），表明急性痛風性關節炎模型大鼠造模成功。

2.2 關節液中性細胞HE染色光鏡下計數 見圖1、表 2。

圖1 大鼠關節液HE光鏡下染色圖（×400）

表2 各組關節液中性粒細胞含量比較

2.3 大鼠膝關節滑膜組織HE染色光鏡下觀察見圖2。圖2顯示：正常組滑膜組織可見極少中性粒細胞，滑膜細胞排列規則，無水腫；模型組滑膜組織可見大量中性粒細胞，滑膜細胞排列不規則，有明顯水腫；痛風寧顆粒組及秋水仙堿組滑膜組織可見少量的中性粒細胞，滑膜細胞排列較規則，輕度水腫。

圖2 大鼠滑膜HE染色圖（×200）

2.4 關節液細胞因子TNF-α、IL-1β檢測結果 見表3。

表3 各組關節液中TNF-a、IL-1β含量比較

2.5 大鼠膝關節滑膜組織中TLR-2、4及MyD88 mRNA表達檢測

2.5.1 RNA純度及完整性鑒定 經測定各組抽提的總RNA結果均滿足OD260／OD280值在1.8～2.0范圍及1%瓊脂糖凝膠電泳中28S和18S條帶清晰的要求。表明提取的總RNA純度高、完整性好。

2.5.2 各組TLR-2、4及MyD88 mRNA相對表達水平的RT-PCR結果 見表4。

3 討 論

Toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）中的 TLR-2、4和其重要的銜接蛋白髓樣分化因子（MyD88）參與了痛風的炎癥反應的發生、發展和消退過程［7-8］。靜息狀態下，TLRs受體與MyD88結合成復合物，未受刺激時處于無活性狀態。當TLRs受體與病原相關分子結合后，受體發生二聚化，胞質中的TLR結構域與MyD88的羧基末端相互作用，MyD88就開始募集下游絲／蘇氨酸蛋白激酶IRAK1和IRAK2，導致IRAK自身磷酸化；磷酸化的IRAK脫離MyD88與TRAF6（TNFR-associated factor）結合，活化的 TRAF6引起 MAP3K（mitogen-activated protein kinase）家族成員 NIK（NF-κβ-inducing kinase）活化；此后又激活 κβ 激酶（κβ kinases，IKKs），導致 κβ 的泛素化而從 κβ／NF-κβ 復合物釋放；NF-κβ 由此活化轉位進核，導致一系列特定基因的表達，從而產生原發性致炎因子如IL-1β、TNF-α等，完成炎癥的信號轉導過程［9-10］。其中與痛風關系密切的細胞因子有IL-1β、TNF-α。IL-1β能激活IL-1受體，致使其它炎癥調節因子及相關趨化因子發揮作用，引起中性粒細胞進入并聚集于尿酸鹽沉積部位；此又可增強IL-1與其受體結合，引起更多中性粒細胞匯聚于尿酸鹽沉積部位；如此正反饋調節，促使急性痛風性關節炎的炎癥產生和發展。而TNF-α能激活NF-κB信號通路，促使IL-1、IL-8等細胞因子分泌及中性粒細胞出現吞噬活性并釋放氧自由基和蛋白水解酶，導致尿酸鹽沉積處出現充血、水腫、大量炎癥細胞浸潤、纖維素滲出，并呈不斷加重［11］。因此，急性痛風性關節炎發病與TLRs／MyD88信號通路的激活，細胞因子IL-1β、TNF-α等的升高及中性粒細胞的聚集等因素密切相關。

表4 各組TLR-2、4及MyD88 mRNA表達情況比較

本實驗觀察到：痛風寧顆粒能夠顯著降低大鼠病變關節關節液中中性粒細胞的含量及細胞因子TNF-α、IL-1β的產生，這與課題組前期利用兔子進行觀察的結果一致［12］，表明痛風寧顆粒具有明顯的抗炎、鎮痛作用；痛風寧顆粒能夠顯著抑制TLR-2、TLR-4及MyD88 mRNA表達，正常組與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05），提示痛風寧顆粒對急性痛風性關節炎的抗炎、鎮痛作用可能是通過抑制TLR-2、4及 MyD88基因的激活，進而減少 TNF-α、IL-1β的生成有關。本研究還顯示：秋水仙堿可以抑制TLR-2、TLR-4及MyD88 mRNA表達，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05），但其結果顯著高于正常組及痛風寧顆粒組，這表明秋水仙堿抗炎、鎮痛的作用機制與痛風寧顆粒作用機制有所不同，需要進一步研究。

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