糖痹顆粒對糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)NGF及SP表達(dá)的影響

謝 勤，渠利華 ，陳曉雯

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230011；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病臨床上常見的慢性并發(fā)癥之一，該病的病理基礎(chǔ)是以高血糖為中心的各種代謝異常和微循環(huán)障礙等多種因素而導(dǎo)致的周圍神經(jīng)損傷。糖尿病病程超過10 a，半數(shù)以上的患者會合并不同程度的周圍神經(jīng)病變，其發(fā)病率隨著年齡增長而逐年升高［1］。DPN發(fā)病機理尚未完全闡明，神經(jīng)營養(yǎng)障礙在DPN中的影響機制日益受到人們的關(guān)注，目前研究也比較多。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于DPN的治療以藥物治療為主，但缺乏特異性治療方法。目前，中藥復(fù)方干預(yù)DPN神經(jīng)營養(yǎng)障礙機制的研究越來越受到重視，特別是對神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)神經(jīng)肽的研究較多，并且取得了一定的成果。本實驗主要研究中藥復(fù)方制劑糖痹顆粒對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）及其表達(dá)產(chǎn)物 P 物質(zhì)（substance P，SP）的影響，探討糖痹顆粒干預(yù)DPN神經(jīng)營養(yǎng)障礙的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級6周齡雄性SD大鼠36只，體重180～220 g，由安徽省實驗動物中心提供［動物許可證號：SCXK（皖）2011-002］。

1.2 實驗試劑及藥物 糖痹顆粒：由黃芪10 g，生地黃 10 g，川芎 6 g，赤芍 10 g，紅花 5 g，桃仁 10 g，全蝎3 g，延胡索10 g，僵蠶10 g等組成（廣州一方制藥廠生產(chǎn)）；兔抗鼠NGF多克隆抗體（巴傲得生物科技有限公司，批號：K0151）；兔抗鼠SP多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：990885W）；SP kit（即用型）及DAB顯色液（北京中杉生物技術(shù)有限公司，批號：K136719H）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司生產(chǎn)，北京索來寶科技有限公司分裝，批號：20120124）。

1.3 實驗主要器材 切片機（Leica RM2135，德國LEICA 公司）；顯微鏡（Nikon 80i，日本 Nikon 公司）；自動脫水機（亞光ZT-12M，湖北孝感亞光醫(yī)用電子有限公司）；石蠟包埋機（亞光YB-7B，湖北孝感亞光醫(yī)用電子有限公司）；干燥箱（精宏DHG-9140A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；冰箱（榮事達(dá)BCD-245F，安徽合肥榮事達(dá)股份有限公司）；JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組 參照徐雁方法造模［2］。選擇清潔級成年雄性SD大鼠36只，體重180～220 g，每籠5只，溫度（20±2）℃，濕度 55%～65%，自由飲水，12 h晝夜周期喂養(yǎng)，普通標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、糖痹顆粒組各12只。模型組和糖痹顆粒組禁食12 h后，將鏈尿佐菌素臨用前用0.l mmol／L 檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.3，4℃）避光條件下配成1%濃度溶液，按50 mg／kg劑量左下腹腔內(nèi)單次注射，72 h后尾靜脈取血，用貝朗血糖測試儀測量血糖，血糖＞16.7 mmol／L者確定成模納入試驗。正常組予以注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。

2.2 給藥方法 成模第2天，各組大鼠均予以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)8周，同時各組給藥如下：糖痹顆粒組大鼠每日生藥量根據(jù)《中藥實驗方法學(xué)》按成人劑量換算為 1.2 g／（kg·d-1）灌服糖痹顆粒，以生理鹽水溶解，每日1次，連續(xù)給藥8周，每2周記錄1次體重、血糖；正常組、模型組灌服相同比例體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周，每2周記錄1次體重、血糖。

2.3 取材 末次給藥后，大鼠禁食不禁水13～14 h，以10%水合氯醛作腹腔麻醉，根據(jù)大鼠體重，注射劑量按350 mg／kg。麻醉成功后，用鋒利剪刀近端從坐骨神經(jīng)切跡處剪斷，遠(yuǎn)端從腓脛神經(jīng)分叉處剪斷，置于中性甲醛中固定，而后石蠟包埋，橫斷面切片，用于免疫組化檢測。同法另取一段坐骨神經(jīng)，戊二醛、鋨酸固定后脫水、包埋，超薄切片，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.4 檢測方法

2.4.1 一般情況觀察 每2周記錄1次各組實驗大鼠體重、飲水量、尿量、血糖等一般情況。

2.4.2 透射電鏡觀察 電鏡下觀察各組大鼠坐骨神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)，在高倍鏡下拍片，主要觀察神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)、排列，髓鞘的厚度、形態(tài)及板層結(jié)構(gòu)，雪旺細(xì)胞的形態(tài)、軸突及其內(nèi)部微絲、微管、線粒體等結(jié)構(gòu)有無變化。

2.4.3 免疫組化檢測 ①石蠟切片（Leica RM2135，厚度2 μm）常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3次各2 min，將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電7 min左右，間隔2～3 min后，再加熱2～3 min，水浴冷卻至室溫。② 滴加3%H2O2，室溫靜置10～15 min，PBS洗3次各3 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置30 min，以減少背景的非特異性顏色，傾去勿洗。③ 依次滴加兔抗鼠1∶250稀釋的NGF抗體（另取同一標(biāo)本切片，P物質(zhì)抗體的稀釋度為 1∶200）50 μL／片，4℃過夜， 過夜后需在37℃復(fù)溫10～20 min，PBS洗3次，每次5 min。④滴加Ⅱ抗工作液 50 μL／片，37 ℃孵育 30 min，PBS洗3次各5 min；加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液50 μL／片，PBS 洗 3 次各 5 min。⑤ DAB 顯色 5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染1 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒；自來水沖洗15～20 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、烤片。⑥ 在高倍視野（40×10）下觀察并拍照，神經(jīng)纖維軸突橫斷面出現(xiàn)特異性的棕黃色顆粒者為陽性，空白對照依舊為淺藍(lán)色。每張切片觀察5個高倍視野，采用JD801圖像分析軟件計算其光密度值（optical density，OD）。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。連續(xù)型變量采用±s表示，同組治療前后均數(shù)比較采用配對t檢驗，組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠一般情況的變化 造模成功后，模型組大鼠均有不同程度的尿量增多，飲水量及進食量增加，活動減少，體重下降，精神不振，體毛缺乏光澤，并出現(xiàn)多種糖尿病相關(guān)并發(fā)癥；糖痹顆粒組大鼠的上述情況較模型組有不同程度的改善；正常組大鼠飲水量、進食量、尿量、體重等一般情況均正常。與正常組大鼠比較，模型組、糖痹顆粒組大鼠在2周、4周、8周的空腹血糖值均明顯升高，有非常顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，糖痹顆粒組第8周的大鼠血糖顯著下降（P＜0.01），第 2、4周比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。說明糖痹顆粒有降低DPN大鼠血糖的作用，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖比較（±s）mmol／L

表1 各組大鼠空腹血糖比較（±s）mmol／L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組 別正常組模型組糖痹顆粒組n 大鼠血糖2周4周8周1210115.48±0.7125.01±3.991）24.44±3.801）5.47±0.6825.86±3.991）22.53±3.391）5.43±0.8326.02±3.791）20.61±2.721）2）

3.2 大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡下觀察正常組大鼠（圖1A）有髓纖維形態(tài)規(guī)則，髓鞘呈板層樣結(jié)構(gòu)，軸突可見神經(jīng)微絲、微管等細(xì)胞器。模型組大鼠（圖1B）有髓神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)嚴(yán)重松散、紊亂，板層分離明顯，可見指紋樣病變以及蜂窩狀結(jié)構(gòu)，多個神經(jīng)纖維髓鞘有水腫和崩解碎片，部分髓鞘出現(xiàn)斑塊狀脫失和節(jié)段性脫髓鞘；有髓神經(jīng)纖維軸索萎縮、變性，細(xì)胞器顯示不清，無髓神經(jīng)纖維線粒體嵴減少，可見毛細(xì)血管擴張，充血。糖痹顆粒組大鼠（圖1C）神經(jīng)纖維髓鞘病變較模型組明顯減輕，軸突稍萎縮，內(nèi)可見微絲、微管等結(jié)構(gòu)，髓鞘有輕微分離現(xiàn)象及斑片狀變化。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)（×8000）

3.3 大鼠坐骨神經(jīng)免疫組化結(jié)果 NGF陽性表達(dá)主要為神經(jīng)元軸突、髓鞘染成棕黃色顆粒，軸突表達(dá)較多，髓鞘表達(dá)較少。其中正常組大鼠坐骨神經(jīng)纖維軸突及髓鞘NGF表達(dá)較多；模型組大鼠神經(jīng)纖維NGF表達(dá)很弱，模型組平均光度值明顯低于正常組（P＜0.01）；糖痹顆粒組大鼠神經(jīng)纖維NGF的表達(dá)較模型組有所上調(diào)（P＜0.05），但與正常組比較有所下降（P＜0.05）。SP的表達(dá)與NGF大致相同，主要在神經(jīng)元的軸突及髓鞘，表達(dá)量的變化趨勢與NGF相似。實驗結(jié)果表明：糖痹顆粒有上調(diào)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)NGF及SP表達(dá)的作用，見表2、圖2-7。

表2 NGF及SP的光度值（±s）

表2 NGF及SP的光度值（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05。

組 別正常組模型組糖痹顆粒組NGF（OD）0.492±0.0560.391±0.0612）0.441±0.0281）3）n 121011 SP（OD）0.351±0.0480.241±0.0582）0.298±0.0471）3）

圖2 正常組大鼠神經(jīng)纖維NGF表達(dá)呈強陽性（×400）

圖3 糖痹顆粒組大鼠神經(jīng)纖維NGF表達(dá)較弱（×400）

圖4 模型組大鼠神經(jīng)纖維NGF表達(dá)很弱（×400）

4 討 論

DPN發(fā)病機理尚未完全闡明，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明DPN的主要機制與代謝紊亂、氧化應(yīng)激、血液流變性異常、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、免疫因素等有關(guān)［3］。目前研究神經(jīng)營養(yǎng)障礙對DPN的影響機制比較多。NGF是發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的一類生長因子，是胚胎感覺、交感神經(jīng)生長發(fā)育必不可少的物質(zhì)，對成年神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持及結(jié)構(gòu)的完整也具有重要的作用［4］。NGF是交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和中樞部分膽堿能神經(jīng)元生長、發(fā)育、存活、功能維持所依賴的營養(yǎng)因子。實驗研究［5］發(fā)現(xiàn)：糖尿病小鼠體內(nèi)NGF水平降低，隨糖尿病病程進展，不同組織的NGF-mRNA進行性下降，尤其是小腿肌肉和坐骨神經(jīng)，且坐骨神經(jīng)中NGF mRNA的表達(dá)水平與其甩尾潛伏期呈負(fù)相關(guān)，與機械痛閾值呈正相關(guān)。動物實驗發(fā)現(xiàn)：給予外源性的NGF可以有效誘導(dǎo)損傷的神經(jīng)再生，并維持外周神經(jīng)屏障的通透性。糖尿病模型小鼠經(jīng)NGF治療，坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維細(xì)胞中細(xì)胞骨架蛋白的密度顯著增加，從而促進了內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，維持了神經(jīng)纖維的正常功能［6］。

圖5 正常組大鼠神經(jīng)纖維SP表達(dá)呈強陽性（×400）

圖6 糖痹顆粒組大鼠神經(jīng)纖維SP表達(dá)較弱（×400）

圖7 模型組大鼠神經(jīng)纖維SP表達(dá)很弱（×400）

SP是一種合成受NGF調(diào)控的神經(jīng)肽，有擴張血管、傳導(dǎo)痛覺等多種作用。SP分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及其他組織中，SP作為一種對靶組織起興奮作用的介質(zhì)，涉及痛覺傳遞，也是感覺神經(jīng)元生長、發(fā)育、成熟的標(biāo)志。SP廣泛分布于神經(jīng)纖維內(nèi)，能直接或間接通過促進谷氨酸等物質(zhì)釋放參與痛覺傳遞。在周圍神經(jīng)組織中，NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)肽SP的表達(dá)，促進SP的發(fā)育。糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)中SP水平明顯降低，痛覺減退是糖尿病神經(jīng)病變的典型癥狀，而傳導(dǎo)痛覺的介質(zhì)神經(jīng)肽SP的減少與痛覺減退相平行［7］。 賈軍宏等［8］觀察糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)SP的變化及NGF對其的影響，結(jié)果表明NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)肽SP的表達(dá)，促進SP的發(fā)育，從而維持周圍神經(jīng)的正常感覺功能。

DPN屬中醫(yī)消渴病日久而致的“脈痹”、“血痹”、“痿證”范疇。糖尿病以陰虛燥熱為本，日久耗氣傷陰，致氣陰兩虛，氣虛無力行血成瘀，陰虛燥熱煉液成痰，痰濁阻絡(luò)，血絡(luò)不通，“不通則痛”而為痹。DPN的病機總屬氣虛血瘀，氣血不能濡養(yǎng)四肢肌肉筋脈，而致肢體麻木疼痛、下肢拘攣。糖痹顆粒正是針對DPN“氣陰兩虛、痰瘀內(nèi)阻”這一關(guān)鍵病機而組方的，全方具有益氣養(yǎng)陰、通絡(luò)止痛之功效。研究［9］表明：活血化瘀等中藥具有顯著的抗凝、溶栓、擴血管、降低血小板黏聚性及降低纖維蛋白原，改善血液流變性及微循環(huán)，并具有一定的軟化血管、增加血管通透性等作用，可減輕或消除血管內(nèi)皮及神經(jīng)細(xì)胞的充血水腫與玻璃樣變。實驗［10］顯示：糖痹顆粒能明顯改善DPN患者血液循環(huán)及血管功能，改善周圍末梢神經(jīng)的缺血低氧狀態(tài)，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，使周圍神經(jīng)獲得更多的營養(yǎng)，從而減輕周圍神經(jīng)的損傷，使損傷的神經(jīng)元得以恢復(fù)。

本實驗研究表明：糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)NGF和相關(guān)神經(jīng)肽SP表達(dá)明顯減少。糖痹顆粒可降低糖尿病模型大鼠的空腹血糖，有效改善糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)病理損傷程度，上調(diào)糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)NGF及SP的表達(dá)量，且主要在神經(jīng)元的軸突及髓鞘的表達(dá)。因此，糖痹顆粒干預(yù)DPN神經(jīng)營養(yǎng)障礙的作用機制可能是通過控制血糖，改善糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)血循環(huán)，緩解神經(jīng)元的缺血、缺氧狀態(tài)，上調(diào)糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)NGF及SP的表達(dá)量，從而減輕神經(jīng)元的損傷，促進損傷神經(jīng)元的修復(fù)。

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