響應(yīng)曲面法優(yōu)化酸奶中嗜熱鏈球菌H1的生長條件

王玉芹, 周 晶, 沙未來

(曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 曲阜 273165)

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵的糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，廣泛分布于土壤、植物根莖、湖泊及以動(dòng)物體內(nèi).從形態(tài)上可分為球菌和桿菌，為兼性厭氧性細(xì)菌，革蘭氏染色為陽性[1].

早在20世紀(jì)20年代初國外就開始益生菌的研究，目前對于嗜熱鏈球菌的研究主要集中于保健作用，抗菌作用，與保加利亞桿菌的共生作用，以及其對酸奶風(fēng)味、感官品質(zhì)、凝乳時(shí)間的影響等領(lǐng)域[2].

現(xiàn)階段我國酸奶發(fā)酵劑的制備技術(shù)大都停留在傳統(tǒng)的人工型發(fā)酵劑水平，包括菌種活化、母發(fā)酵劑、中間發(fā)酵劑、生產(chǎn)發(fā)酵劑等工藝過程，存在活菌含量低、接種量大、生產(chǎn)工序多、勞動(dòng)強(qiáng)度大、無菌技術(shù)要求高、菌種極易污染和退化等弊端[3-5].本研究者采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法對酸奶中嗜熱鏈球菌H1在不同溫度、pH、接種量及鹽濃度條件下嗜熱乳酸鏈球菌的生長情況進(jìn)行了研究，獲得了該菌的最佳培養(yǎng)條件，以期為實(shí)際應(yīng)用中嗜熱乳酸鏈球菌的保存和繼代提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱鏈球菌H1，曲阜師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 培養(yǎng)基

M17改良培養(yǎng)基[6]：蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，牛肉膏0.5%，酵母浸膏0.25%，硫酸鎂0.025%，甘油1%，磷酸二氫鉀0.5%，乳糖0.3%.蛋白胨購自廣州威佳科技有限公司，其它均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在50mL 的M17液體培養(yǎng)基中接種嗜熱鏈球菌H1，分別放入25℃，33℃，37℃，42℃，45℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h確定最佳培養(yǎng)溫度.在pH為5.5，6.5，7.0，7.5，8.5條件下，放置到恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h確定佳的培養(yǎng)pH.在50mL的M17液體培養(yǎng)基中，分別接種菌液0.1 ml，0.2 ml，0.3 ml，0.4 ml，0.5 ml，培養(yǎng)24 h確定其最佳培養(yǎng)接種量.將菌株H1的24h的培養(yǎng)物于2000r/min離心10min，培養(yǎng)基鹽濃度(質(zhì)量濃度，單位g/L)為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，培養(yǎng)24 h確定其最佳鹽濃度.每組均設(shè)置3個(gè)平行樣，最后結(jié)果取三者平均值，以確定最佳培養(yǎng)條件.

1.2.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[7-11]

基于單因素試驗(yàn)，考察M17液體培養(yǎng)基的溫度、pH、接種量、鹽濃度對嗜熱鏈球菌H1的影響.將這4個(gè)因素作為響應(yīng)變量，利用Design-Expert 7.1.6軟件的中心旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)原理，以嗜熱鏈球菌H1在600nm下的吸光度為響應(yīng)值(OD)，通過響應(yīng)面曲面分析得到最優(yōu)生長條件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 嗜熱鏈球菌H1在不同培養(yǎng)溫度下的生長狀況

溫度對嗜熱乳酸鏈球菌H1生長的影響見圖1.結(jié)果表明，嗜熱乳酸鏈球菌H1在25～45℃范圍內(nèi)均能生長，溫度對H1的影響相對較小，無明顯的上升下降趨勢，總的生長活性在42℃時(shí)嗜熱鏈球菌H1達(dá)最高.

圖1 溫度對嗜熱乳酸鏈球菌的影響

2.1.2 嗜熱鏈球菌H1在不同酸堿度條件下的生長狀況

pH對嗜熱乳酸鏈球菌H1生長的影響見圖2.結(jié)果表明，嗜熱乳酸鏈球菌H1的pH值適宜生長范圍較廣，受pH值的影響較小，弱酸和弱堿均能有利于H1的生長，在pH為6.5～7.5時(shí)有較高活性.

圖2 pH值對嗜熱乳酸鏈球菌的影響

2.1.3 嗜熱鏈球菌H1在不同接種量條件下的生長狀況

接種量對嗜熱乳酸鏈球菌H1生長的影響見圖3，結(jié)果表明，該菌在接種量為0.1 mL～0.5 mL的條件下均能生長，上升下降的幅度不是很大，接種量為0.3mL時(shí)嗜熱乳酸鏈球菌H1的生長狀況最好.

圖3 接種量對嗜熱乳酸鏈球菌H1的影響

2.1.4 鹽濃度對嗜熱鏈球菌H1的影響

鹽濃度對嗜熱乳酸鏈球菌H1生長的影響見圖4，結(jié)果表明，鹽濃度在0.2%時(shí)，菌株生長較好，隨著鹽濃度的升高，菌株的生長受到抑制.

圖4 鹽濃度對嗜熱鏈球菌H1的影響

2.2 生長條件優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 該階段的實(shí)驗(yàn)采用中心旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)來對嗜熱鏈球菌H1培養(yǎng)條件的主要影響因子進(jìn)行研究，確定其最佳培養(yǎng)條件.各實(shí)驗(yàn)組的編碼與取值見表1.共30個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為析因點(diǎn)，6個(gè)為零點(diǎn).零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6 次，做誤差估計(jì).

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

運(yùn)用Design-Expert 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，得到實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果，見表2.通過對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合得到響應(yīng)值與各因子的多元回歸方程為：OD=-24.88+1.32A-0.76B+2.66C+11.98D+0.03AB+0.04AC-0.25AD-0.14BC+0.25BD+1.26CD-0.02A2-0.005B2-5.79C2-6.05D2

該模型進(jìn)行回歸分析，方差分析結(jié)果見表3.

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，采用Design Expert 軟件對該模型繪制響應(yīng)曲面圖，得到響應(yīng)曲面圖及其等高線.見圖5～10.

由圖5可知，當(dāng)溫度不變，隨著pH的升高，OD值先升高后降低，當(dāng)pH不變，隨著溫度的升高，OD值先升高后降低，該圖中OD可取到最大值.等高線為橢圓形，說明溫度和pH的交互作用顯著.這與模型的方差分析結(jié)果一致.

圖5 溫度和pH交互影響嗜熱鏈球菌H1生長的響應(yīng)曲面圖及其等高線

由圖6可知，當(dāng)溫度不變，隨著接種量的升高，OD值先升高后降低，當(dāng)接種量不變，隨著溫度的升高，OD值先升高后降低，該圖中OD可取到最大值.等高線為橢圓形，說明溫度

和接種量的交互作用顯著.這與模型的方差分析結(jié)果一致.

圖6 溫度和接種量交互影響嗜熱鏈球菌H1生長的響應(yīng)曲面圖及其等高線

由圖7可知，當(dāng)溫度不變，隨著鹽濃度的升高，OD值呈增加趨勢，當(dāng)鹽濃度不變，隨著溫度的升高，OD值呈下降趨勢.說明該圖體現(xiàn)不出溫度與鹽濃度交互影響嗜熱鏈球菌H1生長最佳條件.但等高線為橢圓形，說明溫度和鹽濃度的交互作用顯著，但不如其他因子之間的交互作用明顯，這與模型的方差分析結(jié)果一致.

圖7 溫度和鹽濃度交互影響嗜熱鏈球菌H1生長的響應(yīng)曲面圖及其等高線

由圖8可知，當(dāng)pH不變，隨著接種量的升高，OD值先升高后降低，當(dāng)接種量不變，隨著pH的升高，OD值先升高后降低，該圖中OD可取到最大值.等高線為橢圓形，說明溫度和接種量的交互作用顯著.這與模型的方差分析結(jié)果一致.

圖8 pH和接種量交互影響嗜熱鏈球菌H1生長的響應(yīng)曲面圖及其等高線

由圖9可知，當(dāng)pH不變，隨著鹽濃度的升高，OD值先升高后降低，當(dāng)鹽濃度不變，隨著PH的升高，OD值先升高后降低，該圖中OD可取到最大值.等高線為橢圓形，說明溫度和接種量的交互作用顯著.這與模型的方差分析結(jié)果一致.

圖9 pH和鹽濃度交互影響嗜熱鏈球菌H1生長的響應(yīng)曲面圖及其等高線

由圖10可知，當(dāng)接種量不變，隨著鹽濃度的升高，OD值先升高后降低，當(dāng)鹽濃度不變，隨著接種量的升高，OD值先升高后降低，該圖中OD可取到最大值.等高線為橢圓形，說明接種量和鹽濃度的交互作用顯著.這與模型的方差分析結(jié)果一致.

圖10 接種量和鹽濃度交互影響嗜熱鏈球菌H1生長的響應(yīng)曲面圖及其等高線

利用Design-Expert 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化，得到優(yōu)化結(jié)果為：當(dāng)溫度41.02℃，pH5.74，接種量0.31mL/mL，鹽濃度0.23%時(shí)，OD有最大值，為1.176.

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

對上面得到的預(yù)測值進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為1.162，其相對誤差<2%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面優(yōu)化嗜熱鏈球菌H1生長條件是極其可靠的.

3 結(jié)果與討論

從酸奶中分離得到的，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究溫度、pH、接種量和鹽濃度對生長條件的影響.再利用Design -Expert 設(shè)計(jì)軟件，采用旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法建立優(yōu)化嗜熱鏈球菌H1最適生長條件的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)回歸分析得到最適生長條件是：溫度41.02℃，pH5.74，接種量0.31mL/mL，鹽濃度為0.23%，嗜熱鏈球菌H1的光密度達(dá)最大為1.176.

從生長溫度條件可知，該菌的最適生長溫度41.02℃要比37℃偏高，但益生菌株在菌液濃縮或制作膨化、顆粒料時(shí)，都要進(jìn)行加熱處理，且在45℃可以檢測到活菌，說明該菌可用于工業(yè)化生產(chǎn).由于動(dòng)物消化道中存在胃酸，能夠抵抗較強(qiáng)的酸性環(huán)境益生菌能在腸道中存活和正常發(fā)揮作用的先決條件[12]，該菌的最適pH為5.74，且在pH為2.5時(shí)仍可檢測到活菌，為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠的依據(jù).

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