β-連環(huán)蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細(xì)胞中起兩個(gè)作用：一是作為細(xì)胞黏附或肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)組分；二是游離的β-catenin作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在基因轉(zhuǎn)錄中起作用。這兩種作用均與腫瘤的演進(jìn)異質(zhì)化過程有關(guān)。目前，對(duì)胃癌β-catenin的研究多側(cè)重于蛋白表達(dá)水平，而其結(jié)構(gòu)改變對(duì)于胃癌演進(jìn)異質(zhì)化的影響報(bào)道較少[1]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法及DNA序列分析法，分析胃癌β-catenin的exon3基因突變及其蛋白表達(dá)情況，從基因水平和蛋白水平探討胃癌β-catenin功能異常的調(diào)控機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及其來源

收集我科2011年9—11月間的新鮮胃癌手術(shù)切除標(biāo)本35例，癌周正常黏膜(距腫瘤邊緣≥5 cm)組織10例。根據(jù)日本胃癌研究會(huì)1995年的分型方案，中分化腺癌6例，低分化腺癌22例，黏液腺癌5例，印戒細(xì)胞癌2例。按Lauren分型方法，腸型6例，混合型4例，彌漫型25例。

1.2 PCR-SSCP方法

1.2.1DNA提取 取液氮保存的新鮮手術(shù)標(biāo)本約1 g，加入4 μL的蛋白酶K(終濃度為0.1 g/L)和DNA提取緩沖液500 μL，55 ℃溫浴3 h，酚-氯仿-異戊醇抽提，冰無水乙醇沉淀，體積分?jǐn)?shù)0.75冰乙醇洗滌，重溶于雙蒸水中，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)及合成 β-catenin外顯子3引物序列參考文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)，序列如下：F 5′-CCAATCTACTAATGCTAATACTG-3′(310 bp)，R 5′-CTGCATTCTGACTTTCAGTAAGG-3′。

1.2.3PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)總體積為25 μL,其中含有基因組DNA 500 ng，4×dNTPs 0.25 mmol/L，Mg2+1.5 mol/L，引物各1 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U和10×buffer 2.5 μL。于PCR循環(huán)儀中94 ℃變性75 s,58 ℃(exon3)退火60 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)30次,最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4電泳、銀染 取PCR產(chǎn)物2～3 μL加等體積變性緩沖液混勻，沸水中變性10 min，冰上驟冷5 min。快速上樣，行80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(丙烯酰胺∶甲雙叉丙烯酰胺=29∶1)。電泳條件:緩沖液1×TBE，環(huán)境溫度4 ℃，恒壓150 V，時(shí)間120～180 min。取下凝膠，于固定液(體積分?jǐn)?shù)0.10乙醇+體積分?jǐn)?shù)0.005冰醋酸)中固定5～10 min，雙蒸水漂洗兩次；凝膠浸泡于染色液(2 g/L硝酸銀)中5～10 min，雙蒸水漂洗兩次；將凝膠浸泡于顯色液(10 g/L氧化鈉+2 g/L甲醛)中顯色，至出現(xiàn)棕褐色DNA區(qū)帶為止。最后用雙蒸水漂洗，觀察結(jié)果。

1.2.5DNA測序 將經(jīng)SSCP篩選β-catenin編碼基因突變陽性的PCR產(chǎn)物100 μL，送至上海生工測序部測序。

1.3 β-catenin蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組織化學(xué)方法。將石蠟標(biāo)本切成5～7 μm厚切片，采用PV-9000兩步法染色，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。兔抗人β-catenin單克隆抗體及PV-9000試劑盒均購于北京中山試劑公司，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。正常組織β-catenin蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞膜呈棕黃色染色，免疫陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核為表達(dá)異常或陰性[2]。

2 結(jié) 果

2.1 β-catenin的exon3 PCR產(chǎn)物

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳證實(shí),每一標(biāo)本都擴(kuò)增出β-catenin的exon3(圖1)。

2.2 β-catenin的exon3的SSCP銀染條帶

PCR擴(kuò)增的雙鏈DNA片段經(jīng)過變性處理后，β-catenin的exon3可以出現(xiàn)2～4條單鏈帶(exon3 310 bp)(圖2)。本文35例胃癌組織中，僅有1例分化不良型胃癌組織β-catenin的exon3出現(xiàn)了異常條帶(圖3)。

2.3 β-catenin exon3突變

檢測到β-catenin的exon3突變1例，突變類型為插入突變。突變標(biāo)本在編碼16位點(diǎn)處插入C堿基(圖4)。

①陰性對(duì)照；②DL2000 Marker；③、⑤胃癌組織的exon3產(chǎn)物；④、⑥癌旁組織的exon3產(chǎn)物。

①為未變性的DL2000 Marker；②～④為癌旁組織；⑤～⑩為胃癌組織。

①、③～⑨為胃癌組織；②為癌旁組織；⑩為未變性的DL2000 Marker。箭頭所示為β-catenin的exon3的SSCP銀染異常條帶。

圖4 β-catenin exon3突變標(biāo)本在編碼16位點(diǎn)處插入C堿基

2.4 β-catenin蛋白表達(dá)情況

癌周胃組織β-catenin連續(xù)性表達(dá)于細(xì)胞膜上。胃癌組織中β-catenin在細(xì)胞膜表達(dá)明顯減弱甚至消失，其中7例(20%)胃癌組織β-catenin在胞漿和胞核內(nèi)異常蓄積表達(dá)，尤其是印戒細(xì)胞癌、低分化胃癌和彌散性浸潤的癌細(xì)胞β-catenin異常表達(dá)率高。

3 討 論

β-catenin通過與E-cadherin胞內(nèi)肽段結(jié)合再與α-catenin結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞黏附，同時(shí)參與Wnt途徑的信號(hào)傳導(dǎo), β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的水平直接反映了Wnt通路的激活水平[4-5]。目前已有研究結(jié)果顯示，多種腫瘤β-catenin基因突變、缺失和蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)變或轉(zhuǎn)位；而β-catenin轉(zhuǎn)位又是細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)變的原因之一，尤其是向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后,該蛋白可通過與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合，并調(diào)節(jié)靶基因如C-myc、MMP7、ID2、CIM4、EphB2和FGF20等的轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和活化[6-7]。

本文免疫組化檢測結(jié)果顯示，胃癌組織細(xì)胞中β-catenin異常表達(dá)。這種異常表達(dá)主要表現(xiàn)在胞漿的蓄積以及出現(xiàn)核定位，同時(shí)細(xì)胞膜上表達(dá)減少。這種異常表達(dá)存在多種機(jī)制，現(xiàn)在已知的機(jī)制主要有β-catenin磷酸化，對(duì)其降解的體系如APC、GSK-3β異常，以及β-catenin基因突變。研究β-catenin在細(xì)胞胞漿、胞核內(nèi)的異常蓄積機(jī)制將有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)惡性腫瘤侵襲、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

已有研究顯示，大多數(shù)β-catenin突變鄰近或位于磷酸化位點(diǎn)上，而第3外顯子含有編碼絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)的序列，導(dǎo)致β-catenin磷酸化位點(diǎn)或其附近的氨基酸序列改變。本文對(duì)exon3基因突變檢測結(jié)果顯示，35例胃癌組織中1例發(fā)生β-catenin的exon3基因突變，免疫組化染色顯示該標(biāo)本細(xì)胞膜β-catenin蛋白表達(dá)減少的同時(shí)，伴有胞漿、胞核的蓄積，說明該病人既存在β-catenin基因的異常，也可能存在胞漿中游離β-catenin的降解體系異常。β-catenin的exon3基因突變率極低，提示β-catenin基因突變是胃癌中β-catenin異常蓄積的機(jī)制之一，但可能不是主要機(jī)制。β-catenin基因可能不是胃癌發(fā)生過程中主要的突變基因。

本文7例(20%)胃癌組織出現(xiàn)β-catenin蛋白胞漿、胞核的異位表達(dá)，僅檢測到1例基因突變，提示其他原癌基因激活的機(jī)制在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究某些病例β-catenin蛋白在細(xì)胞膜中度表達(dá)的同時(shí)，也出現(xiàn)胞漿的蓄積表達(dá)，推測腫瘤細(xì)胞胞漿中游離β-catenin的降解體系發(fā)生了異常。

綜上所述，β-catenin是一個(gè)與胃癌發(fā)生及發(fā)展較為相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，是反映腫瘤惡性程度和病期早晚的可靠指標(biāo)，具有臨床應(yīng)用的價(jià)值和潛力。β-catenin表達(dá)狀態(tài)可能改變癌細(xì)胞的侵襲能力，為研究癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移提供新的思路；β-catenin表達(dá)水平異常有多種機(jī)制，提示臨床可從多角度、多層次了解腫瘤的演進(jìn)和異質(zhì)化。基因突變可能不是胃癌組織中β-catenin異常蓄積的主要機(jī)制。腫瘤發(fā)生過程中β-catenin異常改變的機(jī)制及其在腫瘤發(fā)生過程中的作用需進(jìn)一步研究。

[1] BECKER K F, ATKINSON M J, REICH U, et al. E-cadhe-rin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas[J]. Cancer Research, 1994,54(14):3845-3852.

[2] YUTAKA K, YAE K, MICHIIE S, et al. β-Catenin accumulation and mutation of exon 3 of the β-catenin gene in hepatocellular carcinoma[J]. The Journal of Cancer Research, 1999,90:1301-1309.

[3] 厲建強(qiáng),王文宏,李玉軍,等. β-cat和cyclin D1表達(dá)與胰腺癌臨床病理學(xué)的關(guān)系[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2002,17(3):192-194.

[4] JI J F, YAMASHITA T, WANG X W. Wnt/beta-catenin signaling activates microRNA-181 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Cell & Bioscience, 2011,1(1):4-9.

[5] GOKHALE A, KUNDER R, GOEL A, et al. Distinctive microRNA signature of medulloblastomas associated with the WNT signaling pathway[J]. Journal of Cancer Research and Therapeutics, 2010,6(4):521-529.

[6] KOTOH M W. FGF, Notch, BMP, and hedgehog signaling pathways during carcinogenesis[J]. Stem Cell Reviews, 2007,3(1):30-38.

[7] 張英,林洪生. Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤干細(xì)胞[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2009,17(2):347-350.