紫甘薯醋酒精發(fā)酵階段混菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

尹永祺，張書玉，韓永斌，顧振新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

紫甘薯(Ipomoes batatas L.)是一類集營養(yǎng)、保健和色素于一體的新型甘薯品種[1]。紫甘薯除含有普通甘薯的營養(yǎng)成分外，還富含花色苷[2]、黃酮、綠原酸、果膠和膳食纖維[3]等功能性成分，因而具有抗氧化、抗突變、緩解高血壓、改善肝功能和增強記憶力等多種保健功能[4-6]。目前國內(nèi)外已針對紫甘薯開發(fā)出一系列產(chǎn)品，但多集中于紫甘薯泥[7]、紫甘薯汁[8]和紫甘薯酒[9]等方面，而以紫甘薯釀造食醋的研究鮮見報道。紫甘薯醋不僅營養(yǎng)豐富，且同時兼具紫甘薯和食醋的多種保健功能，符合當(dāng)今保健醋生產(chǎn)消費的發(fā)展趨勢，具有重要的開發(fā)價值和廣闊的應(yīng)用前景。

食醋的酸味柔和與否是評價其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其中揮發(fā)酸的刺激性氣味是制約食醋發(fā)展的關(guān)鍵因素。目前，采用純種酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)的食醋中不揮發(fā)酸含量少，刺激味重，缺乏傳統(tǒng)食醋酸味的柔和性。乳酸菌可將酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的的蘋果酸分解為乳酸，從而提高醋產(chǎn)品中不揮發(fā)酸含量，降低醋酸的刺激味，改善食醋品質(zhì)[10]。目前，國內(nèi)對酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵在食醋酒精發(fā)酵方面系統(tǒng)的研究報道較少。

本研究以紫甘薯為主要原料，采用酵母菌和乳酸菌混菌發(fā)酵，以發(fā)酵液的酒精度和總酸含量為指標(biāo)，對發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，為紫甘薯醋工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

紫甘薯、大米 市售。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 廣東省東莞市丹寶利酵母廠；嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus) 分離自泡菜本實驗室保藏。

α-淀粉酶、果膠酶、糖化酶 江陰市愛頓生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；LDZX-40AI型自動壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；AUY-120型電子天平 日本島津公司。

⑨由于風(fēng)浪影響或水位測量誤差可能造成水閘上下游水位偏差，為防引排倒流，設(shè)定上游水位比下游水位高0.01 m以內(nèi)時，閘門一次性關(guān)到底（不分級關(guān)閘）。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

選用新鮮、無病蟲害、無腐爛的紫甘薯，洗凈、晾干后切成3～5mm薄片，于50℃熱風(fēng)干燥后粉碎，過60目篩，裝于塑料袋中4℃密封貯藏。

大米除雜后粉碎，過60目篩，裝于塑料袋中4℃密封貯藏。

1.3.2 菌種活化

酵母菌活化：按料液比1：100(m/V)將活性干酵母置于30℃水浴復(fù)水20min，加入0.4g/L白砂糖，攪拌均勻，于30℃條件下活化2h備用。

乳酸菌活化：接種乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基，置于30℃靜置培養(yǎng)16h，活化兩次備用。

1.3.3 糖化液制備

將紫甘薯粉按料液比1：5(m/V)添加蒸餾水，70U/g添加α-淀粉酶，于90℃酶解30min；90U/g添加果膠酶，于35℃酶解120min；添加500U/g糖化酶，于60℃酶解60min，制得紫甘薯糖化液。大米糖化液制備除不經(jīng)果膠酶酶解外，方法同上。

1.3.4.1 發(fā)酵溫度的選擇

按體積分?jǐn)?shù)接種0.2%酵母菌、10%乳酸菌于初始發(fā)酵液，分別置于20、25、30、35℃發(fā)酵5d，測定發(fā)酵液酒精度和總酸含量。

1.3.4.2 糖化液體積比的選擇

按體積分?jǐn)?shù)接種0.2%酵母菌，10%乳酸菌于發(fā)酵液，發(fā)酵液中紫甘薯糖化液和大米糖化液體積比分別為3：7、4：6、5：5、6：4和7：3，置于30℃發(fā)酵5d，測定發(fā)酵液酒精度和總酸含量。

1.3.4.3 酵母菌接種量的選擇

按體積分?jǐn)?shù)分別接種0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%酵母菌，10%乳酸菌于初始發(fā)酵液，置于30℃發(fā)酵5d，測定發(fā)酵液酒精度和總酸含量。

1.3.4.4 乳酸菌接種量的選擇

按體積分?jǐn)?shù)分別接種5%、10%、15%、20%、25%乳酸菌(以不接種乳酸菌作對照)，0.2%酵母菌于初始發(fā)酵液，置于30℃發(fā)酵5d，測定發(fā)酵液酒精度和總酸含量。

1.3.4.5 乳酸菌接種時間的選擇

接種0.2%酵母菌于初始發(fā)酵液，分別在發(fā)酵的0、12、24、36h接種10%乳酸菌，置于30℃發(fā)酵5d，測定發(fā)酵液酒精度和總酸含量。

1.3.4.6 發(fā)酵時間的選擇

接種0.2%酵母菌、10%乳酸菌于初始發(fā)酵液，置于30℃發(fā)酵，每隔12h測定發(fā)酵液酒精度和總酸含量。

1.3.4.7 正交試驗優(yōu)化

采用三因素三水平正交試驗，考察酵母菌接種量、糖化液體積比和乳酸菌接種量3種因素對酒精發(fā)酵階段酒精度和總酸含量的影響。

1.3.5 指標(biāo)測定

酒精含量測定：參照王洪臣等[11]方法測定；總酸含量測定：采用酸堿滴定法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度的影響

圖 1 發(fā)酵溫度對酒精度和總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the contents of alcohol and total acid

由圖1可知，在20～35℃范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度增高，發(fā)酵液中酒精度和總酸含量變化趨勢一致，均呈先增加后減少趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，酒精度和總酸含量均達(dá)到峰值，分別為6.3%和0.56g/100g，顯著高于20℃時酒精度和總酸含量。隨著發(fā)酵溫度的進一步增高，酒精度顯著下降，且總酸含量也呈下降趨勢。因此，選擇30℃作為酒精發(fā)酵的發(fā)酵溫度。

2.2 糖化液體積比的影響

圖 2 糖化液對酒精度和總酸含量的影響Fig.2 Effect of volume ratio between saccharified solutions of purple sweet potato and rice on the contents of alcohol and total acid

由圖2可知，隨著糖化液中紫甘薯含量的增加，發(fā)酵液中酒精度呈持續(xù)下降趨勢，而總酸含量呈先增加后減少趨勢。初始發(fā)酵液中紫甘薯和大米糖化液體積相等時，總酸含量最高達(dá)0.56g/100g，顯著高于其他體積比發(fā)酵液中總酸。綜合考慮發(fā)酵液中酒精度和總酸含量，選擇糖化液體積比4：6、5：5和6：4做進一步研究。

2.3 酵母菌接種量的影響

圖 3 酵母菌接種量對酒精度和總酸含量的影響Fig.3 Effect of inoculum amount of yeast on the contents of alcohol and total acid

由圖3可知，酵母菌接種量在0.1%～0.5%范圍內(nèi)，發(fā)酵液中酒精度和總酸含量均隨接種量的增加呈先增加后減少趨勢。酵母菌接種量為0.3%時，發(fā)酵液中酒精度和總酸含量達(dá)最高分別為6.6%和0.56g/100g，隨后酒精度顯著下降。由此可見，酵母菌接種量為0.2%～0.4%為宜。

2.4 乳酸菌接種量的影響

圖 4 乳酸菌接種量對酒精度和總酸含量的影響Fig.4 Effect of inoculum amount of lactic acid bacteria on the contents of alcohol and total acid

由圖4可知，酒精發(fā)酵過程中接種乳酸菌，發(fā)酵液中總酸含量顯著增加，隨著乳酸菌接種量的增加，發(fā)酵液中酒精度和總酸含量變化趨勢相反，酒精度逐步下降，而總酸含量呈上升趨勢。乳酸菌接種量為5%、10%、15%、20%和25%的酒精發(fā)酵液中總酸含量分別為對照的1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍和1.7倍。綜合考慮發(fā)酵液中酒精度和總酸含量，乳酸菌接種量為5%～15%。

2.5 乳酸菌接種時間的影響

圖 5 乳酸菌接種時間對酒精度和總酸含量的影響Fig.5 Effect of inoculation time of lactic bacteria on the contents of alcohol and total acid

由圖5可知，乳酸菌在24h內(nèi)接種對發(fā)酵液中酒精度無顯著影響，發(fā)酵36h時接種酒精度顯著下降；在0～36h接種乳酸菌，總酸含量隨接種時間的延遲呈先快速下降后緩慢回升的趨勢。確定發(fā)酵0h接種乳酸菌，即與酵母菌同時接種，此時發(fā)酵液中總酸含量最高且酒精度較高。

2.6 發(fā)酵時間的影響

圖 6 發(fā)酵時間對酒精度和總酸含量的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the contents of alcohol and total acid

由圖6可知，酒精發(fā)酵階段發(fā)酵液中酒精度和總酸含量變化趨勢一致，84h內(nèi)酒精度和總酸含量均隨發(fā)酵時間的延長而持續(xù)增加，發(fā)酵84h酒精度和總酸含量達(dá)最大值，分別為7.2%和0.63g/100g，隨后其含量均保持相對穩(wěn)定。因此，紫甘薯醋酒精發(fā)酵周期為84h時有利于發(fā)酵液中酒精和總酸的積累。

2.7 發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化

由表1可知，影響酒精發(fā)酵階段酒精生成的因素依次是A＞C＞B，有利于酒精生成的最佳組合是A3B2C2，即酵母菌接種量0.4%，V(紫甘薯糖化液)：V(大米糖化液)5：5，乳酸菌接種量10%；影響總酸生成的因素從主到次為C＞A＞B，其利于總酸生成的最佳組合是A1B2C3，即酵母菌接種量0.2%、糖化液體積比5：5、乳酸菌接種量15%，此時發(fā)酵液總酸含量最高。由于兩指標(biāo)單獨分析出來最優(yōu)條件并不一致，因此，采取綜合平衡法[12]，綜合考慮各因素對指標(biāo)的影響從而確定出最優(yōu)工藝條件。對于因素A，其為A1時，總酸含量最高，但酒精度過低，而為A3時，酒精度最高，但總酸含量過低，為平衡發(fā)酵液中酒精度和總酸含量，因此，因素A選取A2；對于因素B，酒精度和總酸含量的最優(yōu)條件均為B2，故因素B選取B2；對于因素C，其為C3時，發(fā)酵液中酒精度過低，而為C2時，其總酸含量適宜，亦有利于酒精度提高，故因素C選取C2。綜上所述，酒精發(fā)酵的最佳組合為A2B2C2，即酵母接種量0.3%、糖化液體積比5：5、乳酸菌接種量10%，由于此優(yōu)化組合不在9次試驗中，需追加實驗加以驗證。

表 1 酒精發(fā)酵正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of alcohol fermentation

2.8 驗證實驗

表 2 驗證性實驗結(jié)果Table 2 Validation of the optimized fermentation conditions

按正交試驗優(yōu)化的發(fā)酵最優(yōu)條件進行驗證實驗，以確保實驗的準(zhǔn)確性。表2表明，當(dāng)酵母接種量為0.3%、V(紫甘薯糖化液)：V(大米糖化液)為5：5、乳酸菌接種量10%時，酒精發(fā)酵液酒精度達(dá)7.15%，總酸含量達(dá)0.63%，均高于正交試驗結(jié)果中最高含量，故本研究確定的酒精發(fā)酵工藝合理可信。

3 討 論

食醋釀造的酒精發(fā)酵過程中，糖酒轉(zhuǎn)化率直接影響食醋的最終產(chǎn)量，同時其發(fā)酵過程中除產(chǎn)生酒精外，還會積累少量乳酸、檸檬酸及酯類等代謝產(chǎn)物，對食醋風(fēng)味的形成有很大影響[13]。對于液態(tài)酒精發(fā)酵而言，最重要的影響因素包括發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間和營養(yǎng)水平等。單因素試驗中，紫甘薯醋酒精發(fā)酵過程中發(fā)酵液的酒精度和總酸含量隨發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和酵母菌接種量的變化趨勢一致且同時達(dá)到最高值。而在糖化液、乳酸菌接種量和接種時間的影響下，酒精度和總酸含量的變化趨勢有所差別，其達(dá)到峰值條件也不同。優(yōu)化黃瓜醋[14]、紅棗醋[15]、檸檬醋[16]和蘋果醋[17]等醋酸發(fā)酵條件均發(fā)現(xiàn)初始酒精度為6%時醋酸菌發(fā)酵旺盛，醋酸產(chǎn)量最高。而食醋中有機酸的含量對食醋的風(fēng)味質(zhì)量有直接影響，同時，紫甘薯中富含的功能性色素花色苷在酸化環(huán)境中穩(wěn)定性好[18]。因此，酒精發(fā)酵液中酒精度達(dá)6%后，即以總酸含量作為考察酒精發(fā)酵條件的主要指標(biāo)，從而確定糖化液體積比和乳酸菌接種量范圍，通過進一步正交試驗優(yōu)化并確定酒精發(fā)酵最優(yōu)條件。

本研究結(jié)果表明，酒精發(fā)酵過程中接種乳酸菌可顯著增加酒精發(fā)酵液中總酸含量，這與以往報道一致。國建娜[19]發(fā)現(xiàn)在玫瑰醋酒精發(fā)酵階段，添加乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵，可使不揮發(fā)酸的含量提高2.5～3.0倍，認(rèn)為適量的乳酸菌與酒精酵母混合進行酒精發(fā)酵，對產(chǎn)酒精無影響，且乳酸在0.9%以下對酵母還有一定的促進作用。這是由于乳酸菌可將酒精發(fā)酵過程中的蘋果酸分解為乳酸，從而增加不揮發(fā)酸含量[10]。因此，在紫甘薯醋酒精發(fā)酵階段接種適量的乳酸菌不僅可以提高紫甘薯醋中乳酸等不揮發(fā)酸含量，降低揮發(fā)酸帶來的刺激味，從而改善紫甘薯醋風(fēng)味；同時，總酸含量的增加能有效降低酒精發(fā)酵液的pH值，有利于紫甘薯醋釀造后續(xù)實驗中以酒精發(fā)酵液作為提取液提取紫甘薯花色苷，減少對花色苷的破壞[20]。

通過單因素試驗和正交試驗確定紫甘薯醋酒精發(fā)酵階段混菌發(fā)酵最佳工藝條件為酵母菌接種量0.3%、乳酸菌接種量10%、乳酸菌接種時間0h(即與酵母菌同時接種)，V(紫甘薯糖化液)：V(大米糖化液)為5：5、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵84h，發(fā)酵液中酒精度和總酸含量分別為7.15%和0.63g/100g。

[1] BOVELL-BENJAMIN A C. Sweet potato： a review of its past, present, and future role in human nutrition[J]. Advances in Food and Nutrition Research, 2007, 52： 1-59.

[2] 彭強, 高彥祥, 袁芳. 紫甘薯及其花色苷的研究與開發(fā)進展[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(23)： 401-404.

[3] SUDA I, OKI T, MASUDA M, et al. Physiological functionality of purple-fleshed sweet potatoes containing anthocyanins and their utilization in foods[J]. Japan Agricultural Research Quarterly, 2003, 37(3)： 167-173.

[4] TEOW C C, TRUONG V D, MCFEETERS R F, et al. Antioxidant activities, phenolic and β-carotene contents of sweet potato genotypes with varying flesh colours[J]. Food Chemistry, 2007, 103(3)： 829-838.

[5] KOBAYASHI M, OKI T, MASUDA M, et al. Hypotensive effect of anthocyanin-rich extract from purple-fleshed sweet potato cultivar Ayamurasaki in spontaneously hypertensive rats[J]. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2005, 52(1)： 41-44.

[6] CHO J, JONG S K, PHAM H L, et al. Antioxidant and memory enhancing effects of purple sweet potato anthocyanin and cordyceps mush-room extract[J]. Archives of Pharmacal Research, 2003, 26(10)： 821-825.

[7] 李博, 雷激, 湯富蓉, 等. 紫甘薯泥制作工藝的研究[J]. 食品科技, 2011, 36(4)： 81-86.

[8] 廖望, 陸珠華, 許金紅, 等. 紫甘薯汁加工的酶處理技術(shù)研究[J]. 食品工業(yè), 2011(11)： 47-49.

[9] 張明, 王燕. 紫甘薯酒發(fā)酵工藝研究[J]. 釀酒科技, 2011(8)： 53-56.

[10] 李大錦, 王汝珍. 提高液態(tài)深層發(fā)酵食醋風(fēng)味的實用技術(shù)[J]. 中國釀造, 2005(1)： 4-9.

[11] 王洪臣, 李建姝, 劉洪祥, 等. 馬丁儀微量測定醋酸發(fā)酵液的酒精度[J]. 化學(xué)與生物工程, 2008, 25(2)： 73-75.

[12] 李志西, 杜雙奎. 試驗優(yōu)化設(shè)計與統(tǒng)計分析[M]. 北京： 科學(xué)出版社, 2010： 156-160.

[13] 陸正清. 淺析食醋釀造酒精發(fā)酵工藝的管理[J]. 中國調(diào)味品, 2003(10)： 6-8.

[14] 周紅麗, 胡耀華. 黃瓜醋醋酸發(fā)酵工藝的研究[J]. 食品與機械, 2007, 23(3)： 140-142.

[15] 傅力, 胡麗紅, 古麗娜孜, 等. 紅棗醋生產(chǎn)中醋酸發(fā)酵階段最佳工藝條件的研究[J]. 中國調(diào)味品, 2009, 34(8)： 72-75.

[16] 王毅, 劉學(xué)文, 伍學(xué)明. 檸檬果醋醋酸發(fā)酵工藝的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(1)： 75-78.

[17] 原德樹. 液態(tài)深層發(fā)酵蘋果醋及蘋果醋飲料的研制[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(5)： 523-526.

[18] CEVALLOS-CASALS B A, CISNEROS-ZEVALLOS L. Stability of anthocyanin-based aqueous extracts of Andean purple corn and redfleshed sweet potato compared to synthetic and natural colorants[J]. Food Chemistry, 2004, 86(1)： 69-77.

[19] 國建娜. 玫瑰醋糖化與酒精發(fā)酵過程工藝參數(shù)優(yōu)化的研究[D]. 杭州： 浙江工商大學(xué), 2009.

[20] 王琴, 賴金蓮, 王麗娟. 紫甘薯花色苷色素提取方法的研究[J]. 食品工業(yè), 2009(4)： 24-26.