辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞和脂多糖誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞增殖的影響

關(guān)為群，陳雅瑜 （.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州35000；.福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，福建 福州350004）

辛伐他汀（simvastatins）為甲基羥戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶的特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，是臨床上應(yīng)用廣泛的血脂調(diào)節(jié)藥。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有不依賴于其降脂效果的其他多樣性的保護(hù)作用。其抗氧化和抗炎作用，能治療多種炎癥組織［1］；誘導(dǎo)形成血管、促使神經(jīng)細(xì)胞存活并能促進(jìn)其形成神經(jīng)；促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，形成新骨［2］。目前，辛伐他汀在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣大學(xué)者的關(guān)注。辛伐他汀能治療多種炎癥組織，但對(duì)炎癥牙髓組織的效果需進(jìn)一步探討。Yazawa等［3］證實(shí)：辛伐他汀對(duì)牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）的 增 殖 有 劑 量 依 賴性，但是辛伐他汀對(duì)牙髓細(xì)胞（human dental pulp cells，hDPCs）影響的研究尚少，而對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥牙髓細(xì)胞的影響更是未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)hDPCs增殖的影響，為辛伐他汀在牙髓炎領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 三級(jí)生物安全防護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室（PⅢ）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Heal force HF－90，美國(guó)）；生物安全柜（Heal force SW－CJ－2F，上海力申）；倒置相差顯微鏡（Nikon TS－100，日本）；酶聯(lián)檢測(cè)儀（Biotek POWERWAVE，美國(guó)）；6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costor，美國(guó)）。

低糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、EDTA 均為美國(guó)Gibco 公司；辛伐他汀、脂多糖、二甲基亞砜（DMSO）均為美國(guó)Sigma 公司；CCK－8（同仁，日本）。

1.2 hDPCs培養(yǎng) 取18～24歲需劈冠的阻生牙，術(shù)中無(wú)菌狀態(tài)取劈冠露髓的牙齒置于含雙抗的PBS中；無(wú)菌狀態(tài)下取出牙髓組織，并棄根髓1／3，PBS反復(fù)沖洗，去除血污；并將牙髓組織剪成1 mm×1 mm 小塊，置于六孔板中，在組織塊上蓋上蓋玻片，每孔加含100μg·mL－1青霉素、100μg·mL－1鏈霉素的20%FBS DMEM 培養(yǎng)液2 mL；37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)抗波形絲蛋白抗體和抗角蛋白抗體鑒定后，用0.25%的胰蛋白酶、0.02%EDTA 的混合消化液進(jìn)行傳代，取第4～7代hDPCs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 hDPCs的最佳接種密度選擇 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第2代hDPCs，以2×103／孔、4×103／孔、6×103／孔及8×103／孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用含5%FBS DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱；孵育24h后每孔加入10μLCCK－8，分別在其加入后的1，2，3h測(cè)其OD 值。

1.4 不同級(jí)別濃度的辛伐他汀對(duì)正常hDPCs增殖的影響 取生長(zhǎng)良好的第4代hDPCs，以適宜接種于96 孔板，每孔加100μL 細(xì)胞懸液，以5%FBS DMEM 培養(yǎng)液在37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，用PBS洗滌3次。實(shí)驗(yàn)共設(shè)不同濃度的辛伐他汀實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組；其中實(shí)驗(yàn)組使辛伐他汀終濃度為0.001，0.01，0.1，1μmol·L－1的5%FBS DMEM培養(yǎng)液，空白對(duì)照為僅含5%FBS DMEM 培養(yǎng)液。每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，每孔加入相應(yīng)的含藥物培養(yǎng)基100μL。在觀察的1，3，5，7，10d，每孔加入10μL CCK－8后，繼續(xù)培養(yǎng)3h，檢測(cè)450nm 波長(zhǎng)的OD值。

1.5 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)正常hDPCs及LPS誘導(dǎo)的hDPCs的干預(yù) 取生長(zhǎng)良好的第4代hDPCs，以適宜接種于96孔板，每孔加100μL 細(xì)胞懸液，以5%FBS DMEM 培養(yǎng)液在37 ℃、CO2孵育箱中孵育24h后，用PBS洗滌3次。實(shí)驗(yàn)分10組，分別為：正常hDPCs對(duì)照組、LPS 誘導(dǎo)hDPCs對(duì)照組、4種不同濃度辛伐他汀＋正常hDPCs干預(yù)組、4種不同濃度辛伐他汀＋LPS 誘導(dǎo)hDPCs干預(yù)組（LPS的誘導(dǎo)正常hDPCS 的質(zhì)量濃度為10 mg·L－1）。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔液量為100μL。在觀察的1，3，5，7d，每孔加入10μL CCK－8后，繼續(xù)培養(yǎng)3h，檢測(cè)450nm 波長(zhǎng)的OD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間采用方差分析，2組間比較采成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05（P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié)果

2.1 hDPCs的形態(tài)及鑒定 培養(yǎng)皿中蓋玻片將所有組織塊固定在底壁，在培養(yǎng)的第6天見(jiàn)部分組織塊周圍有散在的hDPCs爬出（圖1A），其形態(tài)為長(zhǎng)梭形，胞體豐滿，胞突細(xì)長(zhǎng)，胞質(zhì)均勻，核圓形或卵圓形，聚集成旋渦狀（圖1B）。免疫組化染色結(jié)果顯示：hDPCs抗波形蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性（圖2）。

圖1 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)（×100）A.原代第6天；B.原代第15天Fig 1 Primary HDPC isolation and expansion（×100）A.primary HDPC at 6days；B.primary HDPC at 15days

圖2 第2代hDPCs波形蛋白和角質(zhì)蛋白鑒定（×100）A.波形蛋白染色；B.角質(zhì)蛋白染色Fig 2 Identification of waveform silk and Keratin protein on the second HDPCs（×100）A.expression of waveform silk protein；B.expression of Keratin protein

2.2 hDPCs接種密度生長(zhǎng)曲線 根據(jù)加入CCK－8后，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)不同接種密度hDPCs的OD 值畫(huà)出折線圖（圖3）。進(jìn)行線性趨勢(shì)分析，加入CCK－8后測(cè)1，2，3h的OD 值發(fā)現(xiàn)：以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞接種密度在2×103／孔～8×103／孔之間，同細(xì)胞OD 值呈線性關(guān)系；而3h的相關(guān)性相對(duì)于其他2組較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)考慮到觀察周期比較長(zhǎng)，選擇2×103／孔作為合適的接種密度，并且在CCK－8加入后3h測(cè)其OD 值。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)不同接種密度hDPCs的OD值Fig 3 OD of different hDPCs seeding density at different time points

2.3 不同濃度的辛伐他汀對(duì)正常hDPCs增殖的影響 CCK－8比色OD 值表明（表1），辛伐他汀單獨(dú)作用于hDPCs，藥物濃度為0.001μmol·L－1及0.1 μmol·L－1隨著時(shí)間延長(zhǎng)雖能促進(jìn)hDPCs增殖，但與對(duì)照組相比卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高濃度（1μmol·L－1）則隨著時(shí)間延長(zhǎng)明顯抑制hDPCs增長(zhǎng)（P＜0.05）。0.01μmol·L－1組第1天就能促進(jìn)hDPCs增殖，但其在第3天起對(duì)hDPCs增殖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。成組t檢驗(yàn)分析，空白對(duì)照組第7天與第10天的OD 值相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 特定濃度辛伐他汀對(duì)正常hDPCs及LPS 誘導(dǎo)的hDPCs的作用 從“2.3”項(xiàng)統(tǒng)計(jì)分析得出0.01 μmol·L－1組辛伐他汀對(duì)正常hDPCs增殖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，進(jìn)一步選擇0.005，0.01，0.015，0.05 μmol·L－1組觀察辛伐他汀對(duì)正常hDPCs和LPS誘導(dǎo)的hDPCs干預(yù)作用。

CCK－8比色比較辛伐他汀干預(yù)正常hDPCs增殖情況（表2）：0.005，0.01μmol·L－1組從第1天起對(duì)正常hDPCs促進(jìn)增殖作用，而其在第3天后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而10mg·L－1LPS第1天起促進(jìn)hDPCs增殖，但僅在第3天及第5天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）；0.005，0.01，0.015，0.05 μmol·L－1組從第1 天起都抑制hDPCs的增殖，而0.01μmol·L－1組的抑制效果最明顯，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

辛伐他汀除了調(diào)節(jié)血脂作用外，還有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管生成素合成，改善內(nèi)皮功能，抑制平滑肌增殖作用［4］和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，形成新骨。目前辛伐他汀在口腔領(lǐng)域的少量研究集中在其對(duì)牙周膜細(xì)胞及成骨細(xì)胞的研究，而對(duì)牙髓細(xì)胞的研究尚少。牙髓細(xì)胞是牙髓組織的主要細(xì)胞，而牙髓細(xì)胞的增殖是牙髓和牙本質(zhì)發(fā)育及修復(fù)中的必備條件之一［5］。但臨床上，因?yàn)檠浪柩祝╬ulpitis）作為牙髓病中的最主要疾病，更多的是牙髓細(xì)胞通常受到細(xì)菌等致病因素的侵襲。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，也是其重要致病因子；其主要通過(guò)2條途徑作用于牙髓細(xì)胞，一條是刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，在作用于牙髓細(xì)胞，另一條是直接作用與牙髓細(xì)胞，引起其生物學(xué)特性發(fā)生改變。研究辛伐他汀對(duì)正常hDPCs和LPS 誘導(dǎo)hDPCs的影響有助于為臨床上生理性和病理性的牙髓再生提供思路。

表1 不同濃度辛伐他汀對(duì)hDPCs增殖的影響（±s，n＝4）Tab 1 The effects of simvastatin on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

表1 不同濃度辛伐他汀對(duì)hDPCs增殖的影響（±s，n＝4）Tab 1 The effects of simvastatin on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05，b P＜0.001

表2 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 2 The effects of simvastatin with the different concentrations on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

表2 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 2 The effects of simvastatin with the different concentrations on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

注：與空白對(duì)照組比較：aP＜0.05，b P＜0.01

表3 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 3 The effects of simvastatin with the different concentration on multiplication situation of LPS－induced hDPCs（±s，n＝4）

表3 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 3 The effects of simvastatin with the different concentration on multiplication situation of LPS－induced hDPCs（±s，n＝4）

注：含LPS空白對(duì)照組與含血清空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；0.005，0.01，0.015，0.05μmol·L－1辛伐他汀干預(yù)組與含LPS空白對(duì)照組比較，b P＜0.05，c P＜0.01

之前的研究表明，由于細(xì)胞的種類、他汀類的類型及其濃度不同，辛伐他汀對(duì)細(xì)胞的增殖影響也不一樣。他汀類（包括辛伐他汀）抑制平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì) 胞 的 增 殖［6－9］，卻 促 進(jìn) 纖 維 細(xì) 胞 的 增 殖［7］。Yazawa等［3］用MTT 法發(fā)現(xiàn)：24h的0.1，1μmol·L－1辛伐他汀促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，72h 的0.1 μmol·L－1辛伐他汀抑制牙周膜細(xì)胞增殖；而其BRDU 分析發(fā)現(xiàn)：24h的0.001，0.01，0.1μmol·L－1辛伐他汀促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，72h的1μmol·L－1組辛伐他汀抑制牙周膜細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK－8法測(cè)細(xì)胞活性，其生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。由于96孔板每孔生長(zhǎng)面積僅為0.34cm2，細(xì)胞接種密度的多少與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)接種不同密度的細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞接種密度同OD 值間的線性關(guān)系，來(lái)確定合適的細(xì)胞接種密度，以排除細(xì)胞接種密度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

本實(shí)驗(yàn)顯示，在未經(jīng)任何處理的對(duì)照組hDPCs保持持續(xù)增殖能力，其第7 天與第10 天無(wú)顯著區(qū)別，可能是因?yàn)榧?xì)胞大量增長(zhǎng)產(chǎn)生了接觸抑制。加入不同級(jí)別濃度的辛伐他汀，1μmol·L－1組對(duì)hDPCs有抑制作用；0.001，0.01，0.1μmol·L－1組辛伐他汀均有促進(jìn)hDPCs增殖的作用，但只有0.01μmol·L－1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且增殖效果最佳，是否0.001～0.1μmol·L－1之間有一個(gè)比0.01 μmol·L－1增殖效果更強(qiáng)的濃度？所以我們對(duì)正常hDPCs增殖有意義的0.01μmol·L－1這一級(jí)別的藥物濃度進(jìn)一步細(xì)化，觀察其對(duì)正常和炎癥牙髓細(xì)胞的作用。

LPS是牙髓炎的誘發(fā)因素之一，并且在炎癥牙髓組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了LPS。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Lee［10］和Kim［11］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10 mg·L－1LPS 誘導(dǎo)hDPCs模擬炎癥牙髓細(xì)胞。10mg·L－1LPS從第一天起促進(jìn)hDPCs增殖，與Lee等［10］的結(jié)果相一致。Lee等研究發(fā)現(xiàn)10mg·L－1LPS能促進(jìn)hDPCs的增殖，且細(xì)胞間黏附分子（intracellular adhesion molecule－1，ICAM－1）和血管黏附分子（vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1）表達(dá)量也最高，這2種黏附分子是牙髓組織對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)產(chǎn)物。但第7天雖然對(duì)hDPCs有增殖效果，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期LPS會(huì)導(dǎo)致hDPCs慢慢變性壞死。

0.005，0.01，0.015，0.05μmol·L－1辛 伐 他 汀作用于人正常牙髓細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞，結(jié)果0.005μmol·L－1及0.01μmol·L－1辛伐他汀從第1天起促進(jìn)hDPCs的增殖，而0.01μmol·L－1組增殖效果較好；以上4種濃度的辛伐他汀從第1天起抑制LPS誘導(dǎo)的hDPCs增殖，而0.01μmol·L－1的抑制效果最明顯。Kim 等［12］發(fā)現(xiàn)辛伐他汀促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，其表現(xiàn)出了典型的半胱天冬酶依賴的凋亡特征，即核DNA 降解、金屬基質(zhì)蛋白酶的分裂和半胱天冬酶－3的激活。

綜上所述，高濃度（1μmol·L－1）辛伐他汀明顯抑制正常hDPCs的增殖。而0.01μmol·L－1辛伐他汀能促進(jìn)人正常的hDPCs增殖，而抑制了LPS 誘導(dǎo)的hDPCs的增殖；適宜藥物濃度的確定為我們下一步研究牙髓炎的動(dòng)物模型提供基礎(chǔ)。

［1］ Hoppe C，Kuypers F，Larkin S，et al.A pilot study of the short－term use of simvastatin in sickle cell disease：effects on markers of vascular dysfunction［J］.Br J Haematol，2010，153（5）：655－663.

［2］ Song C，Guo Z，Ma Q，et al.Simvastatin induces osteoblastic differentiation and inhibits adipocytic differentiation in mouse bone marrow stromal cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，308（3）：458－462.

［3］ Yazawa H，Zimmermann B，Asarni Y，et al.Simvastatin promotes cell metabolism，proliferation，and osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells［J］.J Periondontal，2005，76（2）：295－302.

［4］ 夏書(shū)月，康健，姜彥多，等.辛伐他汀對(duì)煙霧暴露大鼠肺泡上皮細(xì)胞的作用［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33（11）：806－810.

［5］ 王清妹，關(guān)為群.不同發(fā)育階段人牙髓組織VEGF及其受體的表達(dá)研究［D］.福建：福建醫(yī)科大學(xué)，2010.

［6］ van Vliet AK，Negre－Aminou P，van Thiel GC，et al.Action of lovastatin，simvastatin，and pravastatin on sterol synthesis and their antiproliferative effect in cultured myoblasts from human striated muscle［J］.Biochem Pharmacol，1996，52（9）：1387－1392.

［7］ Negre－Aminou P，van Vliet AK，van Erck M，et al.Inhibition of proliferation of human smooth muscle cells by various HMG－CoA reductase inhibitors；compatison with other human cell typers［J］.Biochim Biophys Acta，1997，1345（3）：259－268.

［8］ Axel DI，Riessen R，Runge H，et al.Effects of cerivastatin on human arteria smooth muscle cell and migration in transfter cocultures［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2000，35（4）：619－629.

［9］ Vincent L，Chen W，Hong L，et al.Inhibition of endothelial cell migration by cerivastatin，an HMG－CoA reductase inbibitor：Contribution to its anti－angiogenic effect［J］.FEBS Lett，2001，45（3）：159－166.

［10］Lee JC，Yu MK，Lee R，et al.Terrein reduces pulpal inflammation in human dental pulp cells［J］.J Endod，2008，34（4）：433－437.

［11］Kim JC，Lee YH，Yu MK.Anti－inflammatory mechanism of PPARγon LPS－induced pulp cells：Role of the ROS removal activity［J］.Archives of oral biology，2012，57（4）：392－400.

［12］Kim YC，Song SB，Lee MH，et al.Simvastatin induces caspase－independent apoptosis in LPS－activated RAW264.7 macrophage cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，339（3）：1007－1014.