法舒地爾對大鼠心肌缺血再灌注后血管內皮功能影響

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(青島大學醫學院附屬醫院黃島院區心內科，山東 青島 266555)

急性心肌梗死后，盡早行再灌注治療可明顯改善心肌的缺血壞死,但是再灌注同時又可加重心肌的損傷。研究結果顯示，Rho激酶抑制劑法舒地爾具有擬缺血預適應及缺血后處理的保護效應[1-2]，可顯著減輕心肌缺血再灌注(IR)損傷。已知動脈粥樣硬化發生的始動因素是內皮細胞受損，而Rho激酶可通過蛋白激酶-C途徑下調內皮細胞一氧化氮合酶的表達，降低內皮細胞的屏障功能，促進AS的發展[3]。但在急性心肌IR中，Rho激酶與血管內皮細胞功能之間的關系如何，目前鮮有報道。本實驗通過構建大鼠心肌IR模型并予以法舒地爾藥物干預，觀察其對再灌注后血管內皮功能指標一氧化氮(NO)、血管性血友病因子(VWF)及心肌缺血面積的影響，旨在探討Rho激酶抑制劑在急性心肌IR時對血管內皮細胞及心肌的保護作用。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

法舒地爾購于天津紅日藥業股份有限公司，產品批號：1203281。大鼠NO、VWF的ELISA試劑盒及伊文藍購于上海越研生物科技有限公司。TTC染液購于南京建成生物科技有限公司。

1.2 動物

取健康雄性Wistar大鼠30只，體質量為250～300 g，購于青島市藥品檢驗所。

1.3 實驗分組及IR模型的建立

30只大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組(IR組)、法舒地爾組(FH組)，每組10只大鼠。假手術組,只在大鼠冠狀動脈左前降支(LAD)處穿一絲線,但不予結扎。IR及FH組參考文獻[4]的方法，經氣管切開插管，呼吸機輔助呼吸，阻斷左冠狀動脈30 min后再灌注，構建IR模型。FH組于缺血前1 h腹腔注射法舒地爾10 mg/kg，假手術組及IR組于缺血前1 h腹腔注射等量的生理鹽水。

1.4 血清中NO、VWF水平測定

分別于再灌注后2、24 h取血，迅速離心，留取血清標本，-20 ℃保存。嚴格按照試劑盒要求，檢測血清中NO、VWF水平的變化。

1.5 心肌缺血面積的測定

于再灌注后24 h，經大鼠頸總動脈注入10 g/L伊文藍2 mL，2 min后取出完整心臟，沖洗，確定缺血心肌(非缺血區藍色，缺血區白色)。從取出的心臟中分離出左心室(包括室間隔)。從距心尖部位1 cm處，以垂直于左室長軸的方向切下約2 mm厚的薄片；照相后，37 ℃下放入1 g/L的TTC染色15 min，藍色區域為非缺血區，紅色區域為缺血區,梗死區域不著色,拍照，使用圖像分析系統測量，并按照公式計算缺血面積，缺血面積=(缺血區心外膜長度+心內膜長度)/(左心室心外膜周長+心內膜周長)×100%。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中NO、VWF水平比較

與假手術組相比，IR組再灌注2、24 h后血清中NO含量顯著下降，VWF活性顯著升高，差異有顯著性(F=10.08～118.66，q=6.32～19.80，P<0.01)。與IR組相比，FH組再灌注2、24 h后血清中NO含量明顯升高，VWF活性顯著下降，差異有顯著性(q=3.69～17.77，P<0.05)。見表1。

2.2 再灌注24 h后心肌缺血面積比較

IR組與FH組再灌注24 h后心肌缺血面積分別為58.25±13.3、30.67±8.71，兩組比較差異有顯著意義(t=6.01，P<0.05)。

表1 各組大鼠再灌注2、24 h后血清中NO、VWF水平的變化

3 討 論

隨著冠狀動脈再通術的發展，心肌IR損傷日益受到關注。研究表明，心肌IR時，內皮細胞的抗氧化活性大大降低。內皮細胞的功能障礙及NO合成的減少導致中性粒細胞聚集被激活,并釋放大量氧自由基等毒性產物及破壞性蛋白酶,從而改變血管的通透性，影響冠狀動脈微循環[5]。

研究證實，心肌缺血預適應與缺血后處理可顯著減輕心肌IR損傷。單亮等[6]通過比較缺血預處理、缺血后處理對急性IR損傷心肌生化指標的影響，結果顯示，缺血后處理和缺血預處理具有相似的心肌保護作用。而目前一些研究顯示，法舒地爾作為Rho激酶抑制劑具有擬心肌缺血預適應及缺血后處理的心肌保護效應。

WOLFRUM等[1]應用小鼠在體心肌IR模型進行研究,在缺血前1 h腹腔注射FH(10 mg/kg)，結果顯示，再灌注時白細胞聚集及黏附能力明顯降低，并明顯減少心肌梗死面積(減少38%)。另外，HAMID等[2]在缺血35 min和再灌注10 min分別測定Rho激酶活性,結果顯示，Rho激酶活性在再灌注時明顯增高。進一步的研究結果顯示，Rho激酶抑制劑與缺血預適應的保護效應存在共同的信號通路,即通過PI3激酶-AKT-內皮型一氧化氮合酶(e-NOS)信號途徑作用于細胞內終末靶點[7-8]；而其擬缺血后處理的保護效應則與Rho激酶活性在再灌注時明顯增高密切相關[2]。本實驗同樣證實，相比IR組，在缺血前1 h應用法舒地爾可顯著減少IR后心肌缺血面積。

VWF是內皮細胞分泌的一種多聚體糖蛋白，其通過特異的血小板膜受體(糖蛋白Ⅰb-Ⅸ復合物)介導血小板與內皮下層的黏附，其增高有利于血小板的黏附[9]。當內皮細胞受到刺激或損傷時,VWF能夠從內皮細胞分泌到血漿或血管內皮下,是內皮功能損傷的一個敏感指標[10]。

NO在體內由NOS催化L-精氨酸產生，其中受鈣調蛋白可逆性調節的e-NOS，可在低水平上調控NO的產生,參與體內多種生理功能的調節[11]。NOS在心肌IR中起著重要的作用,尤其e-NOS與冠狀動脈舒縮狀態相關。已知NO、e-NOS激活介導缺血預適應的延遲保護效應,是缺血預適應的保護機制之一[12]。近年來研究顯示，Rho激酶抑制劑可通過PI3激酶-AKT-e-NOS信號途徑作用于細胞內終末靶點，對IR損傷起保護作用。其具體機制為：蛋白激酶PI3、AKT可通過磷酸化e-NOS而調節其活性，使e-NOS進一步促進內源性NO產生；NO通過拮抗內皮素、促進血管擴張、保護內皮功能、抑制血小板聚集、抑制心肌和血管內超氧化物形成等發揮保護作用[13]。

本實驗同樣表明，在急性心肌IR時血清中NO含量降低、VWF活性升高,可能原因為IR后氧自由基產生增加,內皮細胞抗氧化活性下降，發生脂質過氧化損傷,導致內皮細胞功能障礙所致。而本實驗結果進一步顯示，應用法舒地爾干預治療后，再灌注時血清中NO含量較IR組有所增加，VWF活性有所下降，表明法舒地爾可能通過抑制Rho激酶活性及激活細胞內PI3激酶-AKT-e-NOS信號通路，促進再灌注期NO的合成，減少內皮細胞損傷，從而降低VWF的分泌。

以往研究表明，Rho/Rho激酶可通過多種信號途徑參與調節細胞的生長、凋亡和細胞周期。而法舒地爾作為Rho激酶抑制劑，可抑制缺血狀態下心肌細胞的凋亡，降低梗死面積。本實驗從另外一方面證實，Rho激酶抑制劑可顯著保護血管內皮細胞功能，為臨床上冠狀動脈再通后的藥物治療提供更多可能證據。

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