茯苓、薏苡仁與冬瓜子對肺纖維化大鼠血清TGF-β1和TNF-α濃度影響

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(1 青島大學醫學院,山東 青島 266021； 2 青島市海慈醫療集團; 3 山東中醫藥大學)

肺纖維化是以肺部炎癥導致肺泡持續性損傷以及細胞外基質的過度沉積為病理特點的一類疾病。大量研究證實，一些細胞因子參與了肺纖維化形成，其中轉化生長因子-β1(TGF-β1)是促進纖維細胞激活向肌成纖維細胞轉化的關鍵因子[1]，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肺纖維化發病中起重要作用，可作為肺泡炎癥活動性標志[2]。西醫對肺纖維化治療習慣上采用糖皮質激素聯合細胞毒藥物等治療，但長期應用毒副作用顯著。近年來中醫藥治療肺纖維化的研究越來越多，并且取得了一定成績。淡滲利濕法治療肺系疾病有較好的療效，并且未見明顯副作用[3-4]。具有淡滲利濕之功的中藥以茯苓、薏苡仁、冬瓜子最為常見。本文通過動物實驗研究茯苓、薏苡仁、冬瓜子對博萊霉素致肺纖維化大鼠模型血清中TGF-β1和TNF-α濃度的影響，探討中醫淡滲利濕法治療肺纖維化的可行性及其機制，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物與分組 清潔級健康雄性Wistar大鼠72只(由山東魯抗醫藥股份有限公司質監中心實驗動物室提供)，體質量180～220 g,月齡2～3月，在室溫18～22 ℃、空氣相對濕度為28%的環境中，每籠6只，利用自然光線并輔以人工光照，適應性飼養1周后開始實驗。按隨機數字表法分為正常對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組、茯苓組、薏苡仁組、冬瓜子組，每組12只。

1.1.2藥物 注射用鹽酸博萊霉素(每支15 mg,日本化藥株式會社生產)，使用前以生理鹽水配制成所需濃度溶液；醋酸潑尼松(每片5 mg,上海信誼藥廠生產)，磨碎溶于生理鹽水中，制成0.4 g/L滅菌水溶液。茯苓、薏苡仁、冬瓜子(青島市海慈醫療集團提供)，制成滅菌濃煎液，其藥物含量分別為1.47、2.20、2.20 kg/L。

1.1.3試劑及儀器 TGF-β1、TNF-α檢測ELISA試劑盒，由欣博盛生物科技有限公司提供；低溫冰箱；Nikon YS100光學顯微鏡及JEM-1230透射電子顯微鏡， 日本Olympus公司產品；RM 2126石蠟切片機，德國LEICA公司產品。

1.2 動物模型制備

按照文獻[5-6]方法，大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛(2 mL/kg)麻醉后，模型對照組及各治療組大鼠氣管內均注入博來霉素溶液(16.7 g·L-1·kg-1)，并輕揉胸部片刻，使其均勻地分布于肺組織內，以制備大鼠肺纖維化模型;正常對照組大鼠注入等體積生理鹽水。造模后,模型對照組大鼠出現體質量下降、進食減少、脫毛、活動減少等癥狀和體征，光鏡下顯示肺泡組織結構嚴重破壞，肺纖維化明顯加重，說明大鼠模型制備成功。

1.3 給藥方法和途徑

造模第2天，各組均開始連續給藥，用藥量據文獻[7]方法計算。醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松6 mg/(kg·d)，茯苓組、薏苡仁組、冬瓜子組藥物量分別為22、33、33 g/(kg·d)，模型對照組及正常對照組給予等體積的生理鹽水，各組均灌胃給藥，每天1次，至實驗結束。

1.4 檢測指標與方法

給藥后14、28 d，各組分別隨機取6只大鼠，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，將四肢及背部固定，打開腹腔，分離腹主動脈，取血5 mL，低溫下離心，取血清，-20 ℃冰箱保存待測；打開并暴露胸腔，摘取右下肺，用中性甲醛固定24 h后石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。參照文獻[8]方法，觀察所選取肺組織的病理變化情況；用雙抗體夾心ELISA法分別檢測大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的含量，操作嚴格按ELISA試劑盒說明書的步驟進行。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠存活率

實驗過程中，模型對照組第26天死亡1只大鼠；余組未出現大鼠死亡。各組存活率比較，差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 各組大鼠肺組織病理改變

肉眼觀察，正常對照組大鼠雙肺呈粉紅色，表面光滑，富有彈性；模型對照組大鼠雙肺顏色暗紅，邊緣可見點狀出血，部分肺葉體積縮小，并可見大小不一灰白色結節，彈性差；其他組處于以上兩組之間。光鏡下正常對照組無明顯病理變化，肺泡結構完整，肺泡壁及肺泡間隔未見增厚，肺泡大小均勻，肺泡腔內未見滲出；模型對照組給藥14 d可見肺組織肺泡炎癥明顯，肺泡間隔增厚，部分肺泡結構破壞，成纖維細胞增殖，膠原基質沉積，至28 d，炎癥細胞浸潤較14 d明顯減輕，肺泡組織結構嚴重破壞，肺纖維化明顯加重。各治療組的肺泡炎癥及纖維化程度較模型對照組均減輕：醋酸潑尼松組見肺臟炎癥細胞浸潤較輕，未見成纖維細胞增殖及膠原基質增多；3個中藥組鏡下可見肺臟炎癥細胞浸潤，肺泡結構破壞不明顯，成纖維細胞及膠原基質增多不明顯。

2.3 各組大鼠血清TGF-β1和TNF-α含量比較

給藥14和28 d，模型對照組大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量均明顯高于正常對照組(F=181.586～488.612,q=28.253～89.142,P<0.05)，模型對照組血清中TGF-β1及TNF-α含量均明顯高于各治療組(q=8.613～75.682,P<0.05)；醋酸潑尼松組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α含量均低于3個中藥治療組(q=3.538～12.563,P<0.05)。治療14 d,3個中藥治療組間TGF-β1及TNF-α含量差異無顯著性(P>0.05);治療28 d,茯苓組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α含量均低于薏苡仁組、冬瓜子組(q=3.953～4.845,P<0.05)；薏苡仁組與冬瓜子組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1、2。

表1 給藥14 d各組大鼠血清TGF-β1和TNF-α含量比較

表2 給藥28 d各組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α含量比較

3 討 論

肺纖維化在古代文獻沒有相應病名，歸于中醫“咳嗽”、“肺脹”、“喘證”、“氣短”、“肺痿”、“肺痹”等范疇[9]。本病以肺、腎、脾氣陰虧虛為本虛，痰濁、熱毒、外邪、瘀血為標實。羅毅[10]認為痰、瘀既是肺纖維化主要的病理產物，也是病情加重的主要因素。《活血化瘀專輯》曰: “血與水，上下內外，皆相濟行，故病血者，未嘗不病水; 病水者，亦未嘗不病血也”，故水行則血自行；王步青等[11]認為津液為患貫穿肺纖維化疾病的全過程，外邪客肺或肺氣虧虛，導致肺氣失常而津液不歸正化，釀成痰濕，阻于肺絡。可見，水液的正常輸布與本病的產生與進展有著密切的關系。三焦是全身氣、水、津、液運行的通道，對人體氣化功能、水液代謝起著重要的調節作用。肺居上焦，肺主氣、主行水等生理功能均與三焦密切相關。三焦對于水液運行有疏通、通導作用，肺對水液的升降出入具有調節作用。可見，氣之升降出入與水液代謝的調節關系密切。臨床研究顯示，肺氣不宣，氣機不暢、痰飲互結與三焦密切相關，淡滲利濕之法利濕、化痰、行水，清痰之源，可祛除因水液代謝功能障礙而產生的初始病理產物——“濕”、“水”、“飲”[3-4]，水液運行得以疏通，氣機調暢，可使三焦通利，恢復氣水津液的運行通道，上焦得通，痰濕隨水而化，淤邪從下焦滲利而去。故在此思路指導下，無論何種證型的肺纖維化，均注意輔以淡滲利濕法治療，可取得良效。茯苓、薏苡仁、冬瓜子均具有利水消腫、滲濕等作用，《世補齋醫書》：“茯苓一味，為治痰主藥，痰之本，水也，茯苓可以行水。痰之動，濕也，茯苓又可行濕?！薄侗静菥V目》：“薏苡仁，陽明藥也，能健脾益胃。虛則補其母，故肺痿、肺癰用之?！?崔禹錫在《食經》評價冬瓜子：“利水道，去淡水。”

本實驗通過氣管內注入博萊霉素水溶液制備動物模型，病理組織觀察顯示肺泡炎至肺纖維化的病變過程，血清中TGF-β1與TNF-α濃度明顯高于正常對照組，與文獻報道一致[12]，說明本實驗建立的大鼠肺纖維化模型是成功的。

已有研究顯示，TGF-β1在促進纖維細胞激活向肌成纖維細胞轉化過程中起著關鍵作用[1]，作為有效的促纖維化因子，TGF-β1過度表達會導致細胞外基質沉積[13]。成纖維細胞在TGF-β1趨化促進下分裂增殖以及成熟分化，并大量合成膠原蛋白，膠原不斷在肺間質增積，而膠原蛋白酶及纖溶酶原激活物的合成被抑制，促進蛋白酶抑制物產生，使細胞外基質的降解減少，另外細胞外基質自身的穩定也受到抑制[2]。TNF-α是一種小分子蛋白，主要在淋巴細胞、巨噬細胞激活后釋放，具有極強的免疫調節特性以及促炎性作用[14]。它會影響多種正常細胞的生長以及分化[2]；在體內外均能刺激白細胞介素-1(IL-1)的生成, IL-1是成纖維細胞潛在的有絲分裂原[15]；它還能刺激肺成纖維細胞增殖，促進膠原沉積[16]；另外，還可通過其細胞毒性作用，使肺泡上皮細胞不斷壞死、脫屑、再生，導致肺纖維化[2]。TGF-β1與TNF-α在肺纖維化發生過程中具有重要意義。

本文的研究結果顯示，模型對照組大鼠血清中TGF-β1與TNF-α明顯高于正常對照組，提示肺纖維化不僅存在肺組織的炎癥反應，還會引起全身炎癥反應；茯苓、薏苡仁、冬瓜子組大鼠肺組織病理顯示肺纖維化不明顯，且血清TGF-β1與TNF-α濃度均低于模型對照組，提示上述3種藥物能有效緩解博萊霉素誘發的肺纖維化進程，其作用機制與下調TGF-β1及TNF-α的水平有關；茯苓組血清TGF-β1與TNF-α水平低于薏苡仁、冬瓜子組，考慮其在緩解肺纖維化大鼠癥狀、減輕肺纖維化的療效上優于薏苡仁、冬瓜子。

綜上所述，茯苓、薏苡仁、冬瓜子對博萊霉素誘導大鼠肺纖維化具有治療作用，為中醫藥治療肺纖維化提供一個新的思路，但其改善肺纖維化的作用機制尚需進一步研究。

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