花生黃烷酮3—羥化酶基因AhF3H的克隆和表達(dá)分析

摘 要：利用花生轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和GenBank EST數(shù)據(jù)庫，首次從花生中克隆了黃烷酮3-羥化酶基因，命名為AhF3H，GenBank登錄號為KF312218。氨基酸序列分析表明，AhF3H與其他植物F3H有較高的同源性。進(jìn)化樹分析表明，AhF3H與大豆、野生大豆F3H的親緣關(guān)系較近。在花生紫色種質(zhì)材料及豐花1號中，AhF3H的相對表達(dá)水平同花青素含量呈正相關(guān)，表明AhF3H在花生花青素合成代謝過程中具有重要作用。

關(guān)鍵詞：花生；花青素；黃烷酮3-羥化酶；基因表達(dá)

中圖分類號：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）11-0001-06

花青素（Anthocyanin）又稱為花色素，是一種酚類色素，廣泛存在于植物中，尤其是花和果實中。其基本結(jié)構(gòu)是3，5，7-三羥基-2-苯基苯并呋喃，即花色素基元。由于花色素基元中R1和R2取代基的不同，形成了各種各樣的花青素。植物中常見的花青素主要有6種，即天竺葵色素（Pelargonidin）、矢車菊色素（Cyanidin）、飛燕草色素（Delphindin）、芍藥色素（Peonidin）、牽牛花色素（Petunidin）和錦葵色素（Malvidin）[1]。由于花青素種類、含量以及生理條件的差異使植物呈現(xiàn)不同的體色或花色。此外，花青素作為一種天然植物色素，安全無毒副作用，并且具有重要的營養(yǎng)價值和藥用價值。

植物花青素生物合成途徑大致可以分為三個階段[2]。第一個階段苯丙氨酸經(jīng)過一系列反應(yīng)生成4-香豆酰CoA，由苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）和4-香豆酰CoA連接酶（4CL）依次催化，這一過程是許多植物次生代謝途徑所共有的；第二個階段4-香豆酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)生成二氫黃酮醇，它是類黃酮代謝途徑的關(guān)鍵步驟，由查耳酮合酶（CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（CHI）和黃烷酮3-羥化酶（F3H）等催化；第三個階段是二氫黃酮醇生成各種花青素：首先，二氫黃酮醇還原酶（DFR）將二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化成無色花青素，然后在花青素合成酶（ANS）的作用下經(jīng)過氧化脫水形成花青素。花青素不穩(wěn)定，最終經(jīng)糖基化、甲基化、酰基化、羥基化等一系列修飾作用形成穩(wěn)定的花青苷。

F3H能夠催化黃烷酮生成二氫黃酮醇，是植物花青素生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶。利用反義RNA技術(shù)抑制香石竹（Dianthus caryophyllus）F3H表達(dá)會使花色發(fā)生不同程度的改變，花瓣由橙色變成淡紅色、甚至白色[3]。在草莓（Fragaria vesca）中反義抑制F3H的表達(dá)則會阻斷花青素合成代謝，影響果實中花青素積累[4]。一些花色及果色突變體植物中F3H的表達(dá)水平受到一定程度的影響，表明F3H在花青素合成代謝過程中發(fā)揮重要作用[5，6]。藍(lán)莓（Vaccinium myrtillus）是一種花青素含量較為豐富的水果，在果實成熟過程中，花青素合成代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H、DFR和ANS均大量表達(dá)，花青素含量急劇增加，果實由綠色經(jīng)紅色變成黑紫色；而紅色和白色突變體果實中基本檢測不到CHS、F3H和ANS的表達(dá)[7]。目前，已經(jīng)從多種植物中克隆了F3H基因，如金魚草（Antirrhinum majus）[5]、矮牽牛（Petunia hybrida）[8]、蘋果（Malus pumila）[9]、葡萄（Vitis vinifera）[10]、玉米（Zea mays）[11]、擬南芥（Arabidopsis thalian）[12]、紫蘇（Perilla frutescens）[13]等。本研究利用花生轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果以及GenBank EST數(shù)據(jù)庫首次克隆了花生F3H基因，并對其在花生紫色種質(zhì)材料及豐花1號中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期為深入探討花生花青素積累的分子機理以及彩色花生分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

11 試驗材料

12 試驗方法

24 花青素含量分析

花青素種類以及含量的差異通常會引起植物體色和花色不同。花生紫色種質(zhì)材料莖、葉片和種皮均呈現(xiàn)紫色，幼苗期的莖和葉片尤為明顯，隨著植株的生長發(fā)育葉片紫色逐漸減弱；而豐花1號在整個生長發(fā)育周期中莖和葉片一直呈綠色。花青素測定結(jié)果顯示，花生紫色種質(zhì)材料中的花青素含量顯著高于豐花1號（圖4）。

圖4 不同花生材料中花青素含量

3 討論

本試驗首次克隆了花生F3H基因，并分析了其在花生紫色種質(zhì)材料及栽培品種豐花1號中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示花生紫色種質(zhì)材料中AhF3H的相對表達(dá)水平明顯高于豐花1號，與花青素含量呈正相關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Jansen G， Flamme W Coloured potatoes （Solanum tuberosum L） anthocyanin content and tuber quality [J] Genetic Resources and Crop Evolution， 2006， 53（7）：1321-1331

[2] He F， Mu L， Yan G L， et al Biosynthesis of anthocyanins and their regulation in colored graps [J] Molecules， 2010， 15（12）：9057-9091

[3] Zuker A， Tzfira T， Ben-Meir H， et al Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene [J] Molecular Breeding， 2002，9（1）：33-41

[4] Jiang F， Wang J， Jia H， et al RNAi-mediated silencing of the flavonone 3-hydroxylase gene and its effect on flavonoid biosynthesis in strawberry fruit[J] Journal of Plant Growth Regulation， 2013， 32（1）： 182-190

[5] Martin C， Prescott A， Mackay S， et al Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus [J] The Plant Journal，1991，1（1）：37-49

[6] Yang Y， Zhao G， Yue W， et al Molecular cloning and gene expression differences of the anthocyanin biosynthesis-related genes in the red/green skin color mutant of pear（Pyrus communis L） [J] Tree Genetics Genomes， 2013， 9：1351-1360

[7] Jaakola L， Mtt K， Pirttil A M， et al Expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin， proanthocyanidin， and flavonol levels during bilberry fruit development [J] Plant Physiology， 2002， 130（2）：729-739

[8] Britsch L， Ruhnau-Brich B， Forkmann G Molecular cloning， sequence analysis， and in vitro expression of flavanone 3β-hydroxylase from Petunia hydrida [J] The Journal of Biological Chemistry， 1992， 267（8）：5380-5387

[9] Davies K M A cDNA clone for flavanone 3-hydroxylase from Malus[J] Plant Physiology， 1993， 103：291

[10]Sparvoli F， Martin C， Scienza A， et al Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilvene biosynthesis in grape （Vitis vinifera L） [J] Plant Molecular Biology， 1994， 24：743-755

[11]Deboo G， Albertsen M C， Taylor L P Flavanone 3-hydroxylase transcripts and flavonol accumulation are temporally coordinate in maize anthers [J] The Plant Journal， 1995， 7（5）：703-713

[12]Pelletier M K， Shirley B W Analysis of flavanone 3-hydroxylase in Arabidopsis seedlings [J] Plant Physiology， 1996， 111：339-345

[13]Gong Z， Yamazaki M， Sugiyama M， et al Cloning and molecular analysis of structural genes involved in anthocyanin biosynthesis and expressed in a forma-specific manner in Perilla frutescens [J] Plant Molecular Biology， 1997， 35：915-927

[14]Mancinelli A， Rossi F， Moroni A Cryptochrome， phytochrome， and anthocyanin production[J] Plant Physiology， 1991， 96：1079-1085

[15]Serrano M， Kanehara K， Torres M， et al Repression of sucrose/ultraviolet B light-induced flavonoid accumulation in microbe-associated molecular pattern-triggered immunity in Arabidopsis[J] Plant Physiology， 2012， 158：408-422

[16]Xia H， Zhao C Z， Hou L， et al Transcriptome profiling of peanut gynophores revealed global reprogramming of gene expression during early pod development in darkness[J] BMC Genomics， 2013， 14（1）：517

[17]Espley R V， Brendolise C， Chagné D， et al Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples [J] The Plant Cell， 2009， 21：168-183

[18]Wang Z， Meng D， Wang A， et al The methylation of the PcMYB10 promoter is associated with green-skinned sport in max red bartlett pear[J] Plant Physiology， 2013， 162（2）：885-896

[19]Furukawa T， Maekawa M， Oki T， et al The Rc and Rd genes are involved in proanthocyanidin synthesis in rice pericarp [J] The Plant Journal， 2007， 49（1）：91-102

[20]Sweeney M T， Thomson M J， Cho Y G， et al Global dissemination of a single mutation conferring white pericarp in rice[J] PLoS Genetics， 2007， 3（8）：e133

[21]Gross B L， Steffen F T， Olsen K M The molecular basis of white pericarps in african domesticated rice： novel mutations at the Rc gene [J] Journal of Evolutionary Biology， 2010， 23：2747-2753