半夏軟腐病內(nèi)生拮抗真菌的篩選及鑒定

摘 要：從浙江、山東、四川、江西采集的135株半夏樣品中分離出76株內(nèi)生拮抗菌，經(jīng)過平板對峙培養(yǎng)法進行初篩和半夏離體塊莖復篩，篩選出2株拮抗真菌SC6和SC7，這2個菌株能完全抑制軟腐病的發(fā)生。通過形態(tài)學和ITS rDNA序列分析，鑒定菌株SC6和SC7均為曲霉屬土曲霉（Aspergillus terreus）。

關(guān)鍵詞：半夏；內(nèi)生真菌；拮抗；鑒定

中圖分類號：S435.672 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）11-0103-04

半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit.]為天南星科多年生草本半夏屬植物，其塊莖可入藥，是一種重要的藥用植物[1，2]。現(xiàn)代藥理研究證明半夏的主要功效有鎮(zhèn)咳祛痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)、抗心律失常、降血脂、抗腫瘤、抗早孕、鎮(zhèn)靜催眠、解毒抗炎、降血壓等，臨床應(yīng)用十分廣泛[3，4]。

自20世紀70年代開始人工栽培半夏以來，半夏栽培面積逐漸擴大。隨著種植規(guī)模的擴大，病害成了限制半夏種植的技術(shù)瓶頸之一，其中軟腐病危害最為嚴重，所以盡快開展半夏軟腐病的生物防治研究已成為亟待解決的問題。在生物防治方面，植物內(nèi)生菌是一類潛力巨大、應(yīng)用前景廣闊的資源微生物，關(guān)于內(nèi)生菌作為生防因子的研究很多，并由此開發(fā)出一些生防菌劑[5]。近年來，國外已有內(nèi)生細菌用于馬鈴薯、水稻、棉花、玉米、甘藍、白菜、番茄和水果產(chǎn)后病害防治的報道；國內(nèi)針對馬鈴薯環(huán)腐病、番茄青枯病、辣椒炭疽病等病原菌也進行了內(nèi)生菌的生防研究[6]，顯示了內(nèi)生菌作為生物農(nóng)藥的良好前景。但內(nèi)生真菌應(yīng)用于軟腐病防治的研究報道較少。

本文主要從半夏中分離內(nèi)生真菌，進行初步的拮抗篩選及鑒定，為探索內(nèi)生菌對半夏軟腐病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品來源：用于內(nèi)生真菌篩選的樣品為采自浙江、山東、四川、江西半夏種植地的135株健康和發(fā)病較輕的半夏植株，保存于牛皮紙袋。

半夏軟腐病原菌：由浙江理工大學生物工程研究所分離保存的胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）SXR1菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理及消毒

將各處理置于28℃培養(yǎng)箱中，7 d后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)。重復3次。

1.2.6 18S rDNA的ITS序列分析

③核酸序列數(shù)據(jù)的分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建：將2個菌株ITS序列用NCBI的BLAST進行比對，用鄰近法（NJ）進行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離

從浙江、山東、四川和江西的半夏種植地共采集半夏135株，按根、球莖和莖分別進行內(nèi)生菌的分離，共獲真菌分離物76株，其中地上莖分離出11株，球莖42株，根部23株；從浙江采集的半夏樣品中分離出38株，山東半夏樣品中19株，四川半夏樣品中10株，江西半夏樣品中9株。

2.2 拮抗菌初篩

用平板對峙培養(yǎng)法對76個真菌分離物進行拮抗效果篩選，結(jié)果篩選出2株拮抗真菌SC6和SC7，抑菌圈直徑均在20.7 mm左右，如圖1所示。

注：圖為接種病原菌后培養(yǎng)24 h時拮抗真菌SC6的拮抗效果。拮抗真菌SC7與SC6效果圖相仿，僅提供SC6的效果圖。下同。

圖1 內(nèi)生拮抗菌對半夏軟腐病的抑菌效果

2.3 拮抗菌復篩

以半夏球莖為篩選材料，由圖2知，A、B、C均未發(fā)病，而D嚴重發(fā)病，說明該2個拮抗菌SC6和SC7不僅對半夏不具有致病力，而且均可有效抑制半夏離體塊莖上軟腐病的發(fā)生，表現(xiàn)出良好的防效，防治效果高達100%。

A：CK（陰性對照）；B：拮抗菌；C：拮抗菌+病原菌；D：病原菌（陽性對照）

圖2 內(nèi)生拮抗菌對半夏球莖軟腐病的抑制效果

2.4 拮抗真菌形態(tài)特征

將內(nèi)生拮抗真菌SC6和SC7分別接種于PDA平皿中培養(yǎng)，菌落和菌體形態(tài)見圖3和圖4。2個菌的形態(tài)均呈白色，初平坦，漸漸表面呈絨狀，生長后期菌落中間呈現(xiàn)沙褐色，菌落反面呈黃色；分生孢子梗光滑無色，有隔膜，頂端膨大成半球形泡囊，從泡囊的頂部至2/3處密生小梗，小梗雙層，分生孢子串生于小梗頂端，分生孢子頭緊密直柱狀，分生孢子小而光滑，近球形。經(jīng)上述形態(tài)觀察初步鑒定為半知菌亞門絲孢菌綱從梗孢目叢梗孢科曲霉屬。

2.5 18S rDNA的ITS序列分析

對PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結(jié)果如圖5，擴增條帶大小約600 bp。

M： Marker；1：SC6；2：SC7

圖5 拮抗真菌SC6 和SC7的18S rDNA的

ITS序列擴增結(jié)果

將2個菌株ITS序列用NCBI的BLAST進行比對，結(jié)果顯示二者之間同源性高達99.9%，只相差一個堿基，結(jié)合上述形態(tài)特征，確定SC6與SC7為同一種菌。用鄰近法（NJ）對2個菌株的ITS序列及相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，SC6結(jié)果如圖6所示（SC7未列出）。可以看出，菌株SC6與曲霉屬土曲霉（Aspergillus terreus）聚為一簇。

根據(jù)真菌SC6和SC7的菌落照片、菌體照片以及18S rDNA ITS測序結(jié)果可以判定菌株SC6、SC7均屬于半知菌亞門絲孢菌綱叢梗孢目叢梗孢科曲霉屬土曲霉（Aspergillus terreus）。

圖6 拮抗真菌SC6的18S rDNA ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗所分離的內(nèi)生真菌相對較少，可能的原因有：一方面本試驗所用培養(yǎng)基為常規(guī)的PDA培養(yǎng)基，其營養(yǎng)成分不一定適合所有種類內(nèi)生真菌的生長，從而導致真菌分離受到局限；另一方面采用組織研磨稀釋法分離，在研磨過程中，可能會有一些菌不能進入上清液，從而使最終統(tǒng)計數(shù)量比實際數(shù)量偏低。另外，因真菌在半夏組織中含量本來就比較少，采用梯度稀釋法不利于含量較低的真菌培養(yǎng)，從而影響最終分離結(jié)果。

參 考 文 獻：

[1] 李玉先，劉曉東，朱照靜.半夏藥理作用的研究述要[J].遼寧中醫(yī)學院學報，2004，11（6）：459-460.

[2] 范美華，周吉源.半夏的研究進展[J].西北藥學雜志，2004，19（2）：90-92.

[3] 張小斌，唐養(yǎng)璇.商洛半夏塊莖腐爛病的原因初探及防治對策[J].商洛師范專科學校學報，2006，20（2）：37-39.

[4] 徐 萍，張學蘭，吳暢灝.半夏的研究進展[J].中國藥業(yè)，2003，12（3）：76-77.

[5] 孔慶科，丁愛云.內(nèi)生細菌作為生防因子的研究進展[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2001，32（2）：256-260.

[6] 石晶盈，陳維信，劉愛媛.植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進展[J].生態(tài)學報， 2006，26（7）：2395-2401.

[7] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1979.