硝基苯降解菌Bacilluscereusyc11—1的鑒定及降解條件優化

摘要： 鑒定了從處理硝基苯廢水的人工濕地中分離出的一株降解硝基苯的優勢菌yc11-1，并采用中心復合設計法優化影響菌株降解硝基苯的因素來提高菌株對硝基苯的降解率。經形態學和菌株的16S rDNA序列分析，菌株yc11-1為蠟質芽孢桿菌（Bacillus cereus）。該菌株降解硝基苯的最佳條件為初始硝基苯濃度84.84 mg/L、菌種投加量12.97%、培養溫度29.4 ℃和pH 7.1，在此條件下理論降解率可達91.14%，實際降解率為90.58%。

關鍵詞：硝基苯；蠟質芽孢桿菌；降解；中心復合設計

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3824-03

硝基苯（Nitrobenzene，NB）為芳烴類化合物，是有機合成的重要中間體及用作苯胺生產的原料。環境中的硝基苯主要是由人類生產活動過程中釋放[1]。硝基苯屬于低毒污染物，但由于硝基苯屬于易燃易爆的危險物質，容易產生環境污染事件，很多國家和組織都將硝基苯作為優先污染物記錄在案[2-5]。硝基苯可以通過多種途徑進入環境，在中國河流中被廣泛檢出，某些達標排放的排污口或排污口附近還是可能存在較大的生態風險[6]。微生物降解法是處理含中低濃度硝基苯類廢水的重要方法，其克服了物理法和化學法處理廢水的低效、高成本和易產生二次污染的缺點[7-9]。微生物降解法的關鍵是用于降解的微生物，目前一些能夠降解硝基苯類化合物的微生物得到了分離[10-14]，但是它們的降解效率不高。研究鑒定了一株從含硝基苯廢水污灌的人工濕地中分離得到的降解優勢菌yc11-1，并通過中心復合設計法對該菌株降解硝基苯的條件進行優化，考察了各因素及其交互作用對硝基苯降解率的影響，并得到降解硝基苯的最優條件，為菌株yc11-1的深入研究和應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株yc11-1從處理硝基苯的人工濕地中分離、篩選得到，保存待用。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。LB培養基：酵母膏5.0 g；蛋白胨10.0 g；NaCl 5.0 g；去離子水1 000 mL；pH 7.0～7.2。無機鹽培養基：K2HPO4 4.35 g；KH2PO4 1.7 g；NH4Cl 2.1 g；MgSO4 0.2 g；MnSO4 0.05 g；FeSO4·7H2O 0.01 g；CaCl2·2H2O 0.03 g；去離子水1 000 mL。按需調節pH，按需添加硝基苯。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分類鑒定 參照《伯杰細菌鑒定手冊》[15]對菌落形態及個體特征進行鑒定。培養24 h的菌株用磷鎢酸鈉染色，OLYMPUS BH-2型光學顯微鏡直接對菌落進行觀察，JEM-1200EX型透射電鏡進行形態觀察。16S rDNA基因片段的PCR擴增參照Kahng等[16]的方法進行，PCR產物純化后委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。在核酸序列數據庫（GenBank）中進行Blast同源性序列比對，根據同源序列搜索結果及構建的菌株系統發育樹，確定菌株的分類地位。

1.2.2 菌種的培養、接種和硝基苯降解 斜面菌種接種至100 mL LB培養基中，在30 ℃、120 r/min下振蕩培養24 h，菌體達到對數生長期后于4 ℃ 6 000 r/min離心5 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，懸浮于無菌水中配制成1×109 CFU/mL的菌懸液。菌懸液按照設計的接種量添加到100 mL無機鹽培養基中，培養72 h后，測定硝基苯的降解率。每個試驗5個平行，取平均值作為測定結果。

1.2.3 硝基苯濃度測定 硝基苯濃度測定采用氣相色譜法。取菌液40 mL轉移至離心管中，4 ℃ 8 000 r/min離心15 min。將25 mL上清液轉移至分液漏斗中，用5 mL苯萃取15 min。將萃取液用0.45 μm孔徑的尼龍膜過濾后氣相色譜測定。色譜柱采用DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，JW Scientific，USA），以高純氮氣作為載體，流速為1.0 mL/min。進樣口和檢測器溫度分別為260 ℃和290 ℃，采用無分流方式進樣，進樣量1.0 μL。程序升溫設為：初始柱溫70 ℃（3 min），30 ℃/min升溫到280 ℃。

1.2.4 降解試驗設計 根據前期試驗結果，選取對硝基苯降解有顯著影響的初始硝基苯濃度、菌種投加量、培養溫度和pH 4個因素作為主要考察因素（自變量），分別以X1、X2、X3、X4表示，每個因素取3個水平，以-1、0、1編碼，根據前期最陡爬坡試驗結果確定各個水平的值（表1）。中心復合法（Central composite design，CCD）設計為4因素2區組28個處理，用SAS 8.0軟件對試驗數據進行回歸擬合，并對擬合方程作顯著性檢驗；繪制對硝基苯降解率具有顯著影響的響應曲面，分析考察影響因素及其交互作用對硝基苯降解率的影響；最后在一定范圍內求取各因素的最適值，得到菌株yc11-1降解硝基苯的最優條件。

2 結果與分析

2.1 菌株的分類地位

2.1.1 形態特征 菌株yc11-1接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上25 ℃培養48 h，菌落呈乳白色，圓形，中部稍凸起，邊緣不整齊，濕潤（圖1A）；菌體革蘭氏染色陽性，顯微鏡觀察菌體呈桿狀，大小約為1.0 μm×1.2 μm，周生鞭毛，可運動（圖1B）。

2.1.2 線粒體16S rDNA序列分析 菌株yc11-1 16S rDNA擴增得到1 380 bp序列，在GenBank中進行Blast比對，構建系統發育進化樹。yc11-1的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的一株蠟質芽孢桿菌Bacillus cereus Hs2-17（JF899264）的16S rDNA序列相似性為98.2%。根據形態學特征與16S rDNA分析結果，確定菌株yc11-1為芽孢桿菌屬蠟質芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.2 降解條件優化結果

2.2.1 回歸方程的建立及顯著性檢驗 采用最小二乘法對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，得二次多元回歸方程模型：

Y=90.50+1.94X1-1.35X12+1.17X2-0.35X22+1.08X3-2.24X32+0.74X4-0.50X42-0.73X1X2- 0.39X1X3-0.21X1X4-1.10X2X3-0.28X2X4+ 0.11X3X4，R2=0.968 8 （1）

式中，Y為硝基苯降解率（%）。

回歸方程的顯著性檢驗結果見表3。由表3可知，失擬項不顯著（P>0.05），且方程決定系數R2=0.968 8，說明該模型擬合度很好，可以用來描述Bacillus cereus yc11-1對硝基苯的降解。回歸方程一次項X1極顯著，X2、X3、X4顯著；二次項X32極顯著，X12顯著；交互項X2X3顯著，其他交互項均不顯著。由此可見，所選4個試驗因素與響應值之間不是簡單的線性關系。菌種投加量（X2）和培養溫度（X3）具有顯著的交互作用。利用SAS 8.0軟件，作出初始硝基苯濃度80 mg/L和pH 7.0水平時菌種投加量和培養溫度的響應曲面（圖2）。從圖2可以看出，培養溫度的適度升高可彌補菌種投加量的不足，提高硝基苯的降解率。這是因為細菌的生長都有其適宜的溫度范圍，適當提高培養溫度有利于細菌的繁殖，從而增加有效微生物的數量。

2.2.2 硝基苯降解最優條件的確定 根據SAS 8.0軟件中的最優分析得出硝基苯降解率取得最大值的條件為初始硝基苯濃度84.84 mg/L，菌種投加量12.97%，培養溫度29.4 ℃和pH 7.1，在此條件下硝基苯的理論預測降解率為91.14%。

2.2.3 驗證試驗結果 為驗證響應曲面法所得結果的可靠性，在上述最優條件下進行硝基苯的降解試驗，5次重復，實際測得硝基苯降解率平均值為90.58%，試驗值在預測值99%的置信區間內，從而表明采用響應曲面法得到的最優條件準確可靠，具有很好的實踐指導作用。

3 小結

從硝基苯污灌的人工濕地中分離出一株硝基苯降解菌，通過形態特征和16S rDNA的核酸序列分析鑒定為蠟質芽孢桿菌，并命名為Bacillus cereus yc11-1。采用中心復合法對Bacillus cereus yc11-1降解硝基苯的條件進行設計，得到降解硝基苯的最優條件：初始硝基苯濃度84.84 mg/L，菌種投加量12.97%，培養溫度29.4 ℃和pH 7.1，在此條件下硝基苯的理論預測降解率為91.14%。試驗結果經驗證是準確可靠的。

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