苦玄參褐斑病病原鑒定及致病因素分析

摘要：為明確近年來(lái)引起廣西梧州地區(qū)苦玄參（Picria felterrae Lour.）褐斑病的病原菌種類(lèi)及致病因素，依據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行了致病性測(cè)定和病原菌驗(yàn)證，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、rDNA-ITS序列分析確定病原菌；通過(guò)對(duì)不同光照條件下病情調(diào)查，分析光照對(duì)該病害發(fā)生的影響。結(jié)果表明，病原菌形態(tài)特征與[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]一致，其rDNA-ITS序列與GenBank中[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]相似性達(dá)99%；強(qiáng)光利于病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)。可見(jiàn)梧州地區(qū)苦玄參褐斑病病原菌為蔥鏈格菌[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]；光照是誘發(fā)苦玄參褐斑病的主要致病因素。

關(guān)鍵詞：苦玄參；褐斑病；病原鑒定； 致病因素

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3836-03

苦玄參（Picria felterrae Lour.）又名苦草、魚(yú)膽草、四環(huán)素草、蛇總管，為玄參科苦玄參屬植物，以全草入藥，是《中華人民共和國(guó)藥典》收載品種[1]，主要分布于廣西、廣東及云南等地，在廣西民間作藥用已有200多年的歷史[2]。

苦玄參作為廣西大宗、道地藥材，是廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司生產(chǎn)的婦炎凈膠囊的主要原料藥材，也是廣西多家制藥企業(yè)生產(chǎn)的炎腫化毒片、炎見(jiàn)寧片、萬(wàn)通炎康片、維威消炎靈等多種中成藥的原料藥材[3]。隨著醫(yī)藥市場(chǎng)需求的逐年增加，苦玄參在廣西梧州地區(qū)廣泛栽培。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)苦玄參褐斑病在梧州各栽培區(qū)普遍發(fā)生，造成葉斑、葉片枯黃，嚴(yán)重者葉片全部卷縮，植株枯死。國(guó)內(nèi)外關(guān)于苦玄參病害的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，褐斑病為首次報(bào)道的苦玄參病害。明確苦玄參褐斑病病原菌對(duì)于該病害的預(yù)防與控制具有重要意義。

環(huán)境因素對(duì)病害的發(fā)生流行起著重要作用，就光照與苦玄參褐斑病的關(guān)系進(jìn)行探討，可以闡明光照在該病害的發(fā)生中的作用，以指導(dǎo)生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 病菌采樣與分離、純化

苦玄參褐斑病典型病葉采自廣西梧州市嶺角鎮(zhèn)武烈村。病原菌的分離及純化參照文獻(xiàn)[4]。采集的病葉用清水洗凈，剪取病葉組織（邊長(zhǎng)4～5 mm的正方形），用75%的乙醇消毒2～3 s，0.1%氯化汞消毒2 min，無(wú)菌水沖洗3遍，置于滅菌濾紙上吸干水，將病葉組織接種在馬鈴薯葡萄糖（PDA）瓊脂培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，對(duì)分離物歸類(lèi)、編號(hào)。純化培養(yǎng)采用單孢分離法純化產(chǎn)孢真菌，采用多次挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)皿純化不產(chǎn)孢真菌，純化后的真菌轉(zhuǎn)管保存。

1.2 致病性測(cè)定[4]

將純化菌株接種至PDA瓊脂培養(yǎng)基，在28 ℃、相對(duì)濕度65%霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器制備直徑9 mm的菌餅。用無(wú)菌接種針在健康的離體苦玄參葉片上刺成面積約為1 cm2的傷口，用接種鏟將菌餅接至傷口，保濕培養(yǎng)3～4 d，觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病葉片病菌進(jìn)行再分離，顯微鏡下觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。以接種PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，在室溫（20～25 ℃）下保濕培養(yǎng)5 d，記錄發(fā)病情況。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將致病菌株移至PDA平板上28 ℃下培養(yǎng)，玻片培養(yǎng)法觀察，記載病原菌的形態(tài)特征，以病原菌菌落形態(tài)、病害癥狀為依據(jù)鑒定病原菌種屬[4]。

1.4 核糖體rDNA-ITS序列分析

采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA[5]。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）擴(kuò)增該菌的rDNA-ITS序列。擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和測(cè)序委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成，將得到的序列在GenBank中進(jìn)行同源性比較[6]。

1.5 光照對(duì)病害的影響

選擇除光照條件不同外，土壤、栽培管理等其他條件均一致的栽培地，采用LI-1400型便攜式光量子輻射計(jì)分別測(cè)定各栽培地的光照強(qiáng)度。對(duì)不同光照條件下的苦玄參進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，每地塊隨機(jī)調(diào)查5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)查20株，每株調(diào)查10張葉片，調(diào)查葉片病級(jí)情況（分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1），統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)及病情指數(shù)[7]。

病情指數(shù)=（各級(jí)病級(jí)代表值×該病級(jí)病葉數(shù)）/（調(diào)查葉片數(shù)×發(fā)病最重級(jí)代表值）×100。

2 結(jié)果和分析

2.1 病害癥狀

苦玄參褐斑病在廣西梧州始于5月初，苗期可見(jiàn)癥狀發(fā)生，但為害不嚴(yán)重。6月下旬至8月是苦玄參的田間生長(zhǎng)旺期，也是病害發(fā)生高峰期。多從靠近心葉的2～3片葉片開(kāi)始發(fā)病，受害葉片初期病部呈水漬狀淡黃小點(diǎn)，病斑不斷擴(kuò)大，形成不規(guī)則黃褐色斑塊，大小為0.2～0.4 cm×0.5～0.8 cm，病健交界處為紫褐色（圖1a）。天氣或環(huán)境潮濕時(shí)，病葉呈水漬狀；天氣或環(huán)境干燥時(shí)病斑穿孔。后期病斑連片，病葉卷縮，呈火燒狀。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌分離、純化 患褐斑病苦玄參組織26 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后長(zhǎng)出菌落，共分離到5株真菌菌株。

2.2.2 致病性測(cè)定 將分離所得的5株菌株室內(nèi)接種至健康的離體苦玄參葉片上保濕培養(yǎng)5 d，僅K-1-2菌株接種的發(fā)病（圖1a），其他未發(fā)病。發(fā)病葉片表現(xiàn)出明顯的褐色水漬狀斑點(diǎn)，對(duì)病葉進(jìn)行病菌再分離接種，獲得與原分離菌株一致的菌株。根據(jù)柯赫氏法則，確定試驗(yàn)中分離的K-1-2菌株為苦玄參褐斑病的病原菌。

2.2.3 病原菌的形態(tài)特征 菌株K-1-2在PDA瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，有同心輪紋（圖1b），初期菌絲白色，6～7 d后呈灰白色，菌絲顏色逐漸加深，從平皿背面觀察到培養(yǎng)基的顏色逐漸加深至黑色。顯微鏡下觀察，分生孢子梗單生或5～10個(gè)簇生，淡褐色有隔膜2～3個(gè)，不分枝或不規(guī)則稀疏分枝，大小為30～100 μm×4～9 μm，其上著生分生孢子。分生孢子褐色，常單生，直或略彎，倒棍棒狀，或孢子本體橢圓形，至喙部（嘴胞）漸細(xì)，分生孢子具縱橫隔膜5～15個(gè)，縱隔膜1～6個(gè)（圖1c），大小為6～130 μm×15～20 μm，最長(zhǎng)的可達(dá)300 μm，喙部直或彎曲，具隔膜0～7個(gè)，大小45～432 μm×2～4 μm。根據(jù)病原菌上述形態(tài)特征，參照文獻(xiàn)[8，9]，發(fā)現(xiàn)符合半知菌亞門(mén)鏈格孢屬蔥鏈格孢[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]的菌落和孢子特征，初步鑒定病原菌為蔥鏈格孢。

2.2.4 病原菌核糖體DNA-ITS序列分析 采用通用引物ITS1/ITS4對(duì)苦玄參褐斑病病原菌菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到1個(gè)大小約為500 bp的片段；經(jīng)序列測(cè)定確定該片段全長(zhǎng)451 bp（圖2），1～51 bp為部分18 S rDNA，52～201 bp為ITS1，202～351 bp為5.8 S rDNA，352～401 bp為ITS4，402～451 bp為部分5.8 S rDNA。將上述測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行同源性分析，得知該病原菌株與Alternaria porri（ELL.）Ciferri的同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)鑒定，確定該病原菌為Alternaria porri（ELL.）Ciferri。

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)病害發(fā)生的影響

對(duì)不同光照條件下的苦玄參發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果（表2）表明，苦玄參褐斑病隨著光照強(qiáng)度的增加而加重。觀察發(fā)現(xiàn)，全光照環(huán)境中種植的苦玄參，葉片病斑多、皺縮，植株較細(xì)小，分蘗不旺盛，生長(zhǎng)后期不封行；設(shè)有一層遮陽(yáng)網(wǎng)栽培的苦玄參，與不遮陽(yáng)相比，發(fā)病率及病情指數(shù)均明顯降低；在蔭蔽的竹林邊，苦玄參植株生長(zhǎng)旺盛，莖稈粗壯，葉片厚且濃綠，生長(zhǎng)后期封行。說(shuō)明強(qiáng)光利于病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)，光照過(guò)強(qiáng)是誘發(fā)苦玄參褐斑病發(fā)生的重要因素，光照強(qiáng)、溫度高、濕度大極易造成褐斑病流行。

3 小結(jié)與討論

鏈格孢屬（Alternaria）真菌能侵染多種植物引起葉斑病，是植物葉部病害常見(jiàn)病原菌[10，11]。本研究在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)苦玄參褐斑病病原菌的rDNA-ITS進(jìn)行分析比對(duì)，從分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步明確了蔥鏈格孢為苦玄參褐斑病的病原真菌。苦玄參是蔥鏈格孢的新記錄寄主。

苦玄參生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶丘陵、山谷的雨林或季節(jié)性雨林下，是一種喜溫暖濕潤(rùn)耐陰的植物[12]。近年來(lái)大面積擴(kuò)植，很多直接種植在水田改的旱地里，日照時(shí)數(shù)及強(qiáng)度均大大增加，田間苦玄參褐斑病發(fā)生嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明，光照是該病害的重要致病因子，建議在選擇栽培地的時(shí)候重視遮陰條件，最好選擇在自然蔭蔽環(huán)境下種植（如林下），不僅滿足遮陰條件而且較為陰涼、通透，不利于病害的流行。

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