蕨菜組織培養的消毒方法比較

摘要：以蕨菜[Pteridium aquilinum （L.） Kuhn var. latiusculum（Desv.） Underw. ex Heller]粗壯、幼嫩的莖段為外植體實施組織培養，比較了不同的消毒步驟及洗刷處理對蕨菜莖段的消毒效果。結果表明，用柔軟毛筆對蕨菜莖段表面洗刷1 min，再用75%的乙醇浸泡15 s，接著用1.0 g/L的HgCl2溶液處理5 min，取得了組織培養最佳的消毒效果，其污染率為15.0%，成活率達66.7%，是試驗范圍內效果最佳的消毒方法。

關鍵詞：蕨菜[Pteridium aquilinum （L.） Kuhn var. latiusculum（Desv.） Underw. ex Heller]；組織培養；外植體；消毒

中圖分類號：S647；Q943.1；Q94-336 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3852-04

蕨菜[Pteridium aquilinum（L.）Kuhn var. latiusculum（Desv.）Underw. ex Heller]屬鳳尾蕨科（Pteridaceae）蕨屬（Pteridium Gled.ex Scop）多年生草本植物，又名如意菜、龍頭菜、拳頭菜、貓爪子菜等[1]。作為蔬菜食用，其營養豐富、質脆、味鮮，具有特別的清香味。研究分析表明，蕨菜嫩葉的營養成分齊全且含量高，每100 g可食部分含水分86.0 g、蛋白質1.6 g、脂肪0.4 g、糖類10.0 g、粗纖維1.3 g、鈣2.4 mg、磷29.0 mg、鐵6.7 mg，尤其是蕨菜內含有17種氨基酸，其中人體必需的賴氨酸（Lysine）、色氨酸（Tryptophane）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、蛋氨酸（Methionine）、蘇氨酸（Threonine）、異亮氨酸（Isoleucine）、亮氨酸（Leucine）、纈氨酸（Viline）8種氨基酸除色氨酸外都含有一定的比例，它們占了蕨菜氨基酸總含量的39.4%[2，3]。另外，在藥理方面，蕨菜的根莖或全草可入藥，具有較高的藥用價值；從中醫藥角度來看，蕨菜味甘性寒，具清熱化痰、降氣潤腸、活血化淤、安神利尿之功效，經常食用對軟化血管、降低膽固醇含量、預防類風濕性關節炎與心臟病及癌癥均有療效[3，4]。由于蕨菜的高營養、高醫療保健作用和回歸自然、無公害等高品質的不斷發掘，使其成為都市人渴望“回歸自然”的“野味食品”[5，6]。特別是近幾年來蕨菜大量地出口日本、韓國、新西蘭等發達國家，造成價格持續上升，進而成為山丘地帶農民脫貧致富的新門路[7]?，F在的蕨菜市場呈供不應求的局面，隨之而來的是人們對野生蕨類植物的過度采摘，這嚴重影響了其資源的可持續利用，導致產量逐年減少[8]。為滿足人們對食用蕨菜的需求，對野生蕨菜實行人工繁殖已經刻不容緩。目前在蕨菜種植方面，國內大多采用蕨菜根莖進行無性繁殖，但其繁殖系數低、不便運輸；也有采用孢子實施有性繁殖，但因季節的影響使孢子采集不易。上述問題利用植物組織培養方法生產再生植株可以解決[9，10]；但是在植物組織培養實際操作中，以野生蕨菜的莖段作為外植體時出現的污染率很高，并成為組織培養成功與否的關鍵環節。為此試驗采用不同消毒步驟和洗刷方式對蕨菜莖段進行了外植體成活率的影響研究，探索蕨菜外植體的消毒規程，以期為蕨菜人工組織培養快速繁育技術的制訂提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蕨菜的幼嫩莖段，采于廣西壯族自治區百色市郊外的麒麟山山麓。采集時選擇粗壯、第一片葉還未長出的幼莖，取幼莖頂點以下10 cm左右較易折斷、無維管絲相連的莖段。

試劑有乙醇、HgCl2、KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·7H2O、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸；所有試劑都為分析純。

儀器主要是百色學院化學與生命科學系實驗室已有的人工氣候培養箱、無菌接種工作臺、高壓滅菌釜、電子天平、手術刀等，以及三角瓶、試管、燒杯、量筒、吸管、試管刷、毛筆等試驗器皿及用品。

1.2 方法

1.2.1 誘導培養基配制 蕨菜組織培養采用的誘導培養基為1/2MS（Murashige and Skoog）培養基+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，1/2MS培養基的組成為：①大量元素，KNO3 950 mg/L、NH4NO3 825 mg/L、KH2PO4 85 mg/L、MgSO4·7H2O 185 mg/L、CaCl2·2H2O 220 mg/L；②微量元素，KI 0.83 mg/L、H3BO3 6.20 mg/L、MnSO4·4H2O 22.30 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.60 mg/L、Na2MoO4·2 H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.03 mg/L、CoCl2·6H2O 0.03 mg/L、Na2-EDTA 37.30 mg/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L；③其他有機營養成分，肌醇100.0 mg/L、甘氨酸2.0 mg/L、鹽酸硫胺素0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇0.5 mg/L、煙酸0.5 mg/L；培養基pH調為5.6～5.8。

1.2.2 外植體的預處理 將采集回來的蕨菜樣品選擇粗壯、幼嫩的莖段，把較細的莖端和較老的部分切除，隨后將篩選好的外植體放入大燒杯中用自來水浸洗5 min（可用清潔洗滌劑），再用流水沖洗10 min，盛入合適的燒杯中，晾干后帶入無菌接種室備用。

1.2.3 表面消毒試驗 在接種室將蕨菜外植體先用75%乙醇浸泡15 s，再迅速用無菌的去離子水浸洗3 min；然后分別用0.5、1.0、2.0 g/L的HgCl2溶液浸泡5 min或8 min，構成6個處理，處理1為HgCl2溶液濃度0.5g/L、消毒時間5 min；處理2為HgCl2溶液濃度0.5g/L、消毒時間8 min；處理3為HgCl2溶液濃度1.0 g/L、消毒時間5 min；處理4為HgCl2溶液濃度1.0 g/L、消毒時間8 min；處理5為HgCl2溶液濃度2.0 g/L、消毒時間5 min；處理6為HgCl2溶液濃度2.0 g/L、消毒時間8 min。各處理再用無菌的去離子水浸洗3次，每次3 min，做HgCl2濃度和處理時間的消毒篩選試驗。將表面消毒處理后的蕨菜外植體接種到配制好的誘導培養基中，每處理接種60瓶，共接種360瓶，并將接種好的培養瓶置于溫度25 ℃、空氣相對濕度70%、光照度2 000 lx、光照時間13 h/d的人工氣候培養箱中，培養20 d后統計已污染的外植體，計算污染率[11，12]，污染率=（污染外植體瓶數/接種外植體總瓶數）× 100%。將未污染的外植體取出，用手術刀將其解剖開，觀察莖內部的壞死情況，將有綠色存活的外植體視為成活，計算成活率，成活率=（未污染且發生萌動的瓶數/ 接種外植體總瓶數）× 100%。

1.2.4 洗刷處理試驗 將預處理后的蕨菜外植體分成3個處理。處理7不做洗刷處理，只是浸泡，作為對照（CK）；處理8用柔軟毛筆對每根蕨菜莖段表面洗刷1 min；處理9用試管刷對每根蕨菜莖段表面洗刷1 min。再將3個處理蕨菜莖段帶入無菌接種室，先用75 %乙醇浸泡15 s，迅速用無菌的去離子水浸洗3 min；然后用1.0 g/L的HgCl2浸泡5 min，再用無菌的去離子水浸洗3次，每次3 min。將洗刷處理后的3組蕨菜外植體接種到配制好的誘導培養基中，每處理接種60瓶，共接種180瓶，并將接種好的培養瓶置于溫度25 ℃、空氣相對濕度70%、光照度2 000 lx、光照時間13 h/d的人工氣候培養箱中培養，20 d后統計已污染的外植體，計算污染率；將未污染的外植體取出，用手術刀將其剖開，觀察莖內部的壞死情況，將有綠色存活的外植體視為成活，計算成活率。

2 結果與分析

2.1 表面消毒方法對蕨菜組織培養外植體成活率和污染率的影響

經過20 d的組織培養后，不同的HgCl2溶液濃度與消毒時間處理對蕨菜外植體的成活率和污染率影響結果見表1和圖1。由表1和圖1可以看出，蕨菜外植體在先用75%乙醇處理15 s、再用HgCl2消毒5 min的前提下，隨著HgCl2溶液濃度的遞增，污染瓶數、污染率呈降低的變化趨勢，其成活瓶數、成活率先增加后減少，在HgCl2溶液濃度為1.0 g/L時達最大值（63.3%）；而當HgCl2溶液消毒時間為8 min時，隨著HgCl2溶液濃度的遞增，污染瓶數、污染率、成活瓶數、成活率均呈下降的變化趨勢；在同一HgCl2溶液濃度下，隨著消毒時間的延長，污染瓶數、污染率、成活瓶數、成活率也呈下降的變化趨勢。由此可見，高濃度、長時間的HgCl2溶液處理能夠有效降低蕨菜莖段在組織培養過程中的污染程度，但同時也降低了蕨菜莖段的成活率；因此在綜合比較后，確定試驗中HgCl2溶液濃度為1.0 g/L、消毒5 min的處理是蕨菜莖段組織培養最佳的消毒方法。

2.2 洗刷處理方式對蕨菜組織培養外植體成活率和污染率的影響

經過20 d的組織培養后，不同的洗刷處理方式對蕨菜外植體成活率和污染率的影響結果見表2。通過表2可以看出，經過毛筆和試管刷洗刷后的蕨菜莖段在組織培養過程中的污染瓶數和污染率都比對照降低，以試管刷洗刷的處理污染率最低，僅為11.7%，比對照20.0%的污染率降低了8.3個百分點，比毛筆洗刷處理后15.0%的污染率降低了3.3個百分點。但在成活瓶數和成活率方面，經毛筆洗刷后的處理成活率最高，達到了66.7%，比對照的63.3%成活率提高了3.4個百分點；而經過試管刷洗刷的處理卻降低了成活率，僅為51.7%，比對照還降低了11.6個百分點，比毛筆洗刷處理更是降低了15.0個百分點。綜合比較后認為，用毛筆洗刷外植體是較合適的蕨菜莖段組織培養洗刷處理方式，其能減少蕨菜莖段在組織培養過程中的污染數和污染率，并提高了成活率。

3 小結與討論

外植體消毒是組織培養技術的第一步基礎工作，也是最重要的步驟；消毒不徹底將嚴重影響組織培養過程中愈傷組織的誘導[13]。在試驗過程中，蕨菜莖段接種幾天后外植體表面就出現了褐化現象，不過莖段上的凹痕卻能長時間保持綠色，只有一部分在培養10 d左右后逐漸全段褐化。這些全段褐化的外植體大多為較細的莖段和莖段頂端極幼嫩的部分。培養的第一周，污染主要是由真菌造成的；第二周的污染數減少，污染主要是由細菌造成的。通過20 d的培養后取出外植體，用手術刀從凹痕處切開，結果顯示凹痕還顯綠色的外植體其內部依然保持著鮮活狀態，水分含量也變化不大；而凹痕已經全段褐化的外植體一部分內部有鮮活組織存在，但是活組織的分布向莖段中心縮減，甚至一些活組織變成黃綠色，另一部分外植體的內部基本無綠色組織存在，試驗將這些無綠色組織的外植體視為死亡。如處理3在用75%乙醇消毒15 s后，接著用1.0 g/L 的HgCl2溶液消毒5 min，則消毒效果較佳，此處理的污染率為20.0%，成活率達63.3%；還有大約16.7%（10瓶）的蕨菜莖段未污染，但也未能成活；這可能是由于75%乙醇的穿透能力較強，加之HgCl2的強滅活能力，造成這部分蕨菜莖段的死亡。

由于蕨菜生長在野外環境里，處在微生物的包圍中，加上蕨菜莖段表面生有細毛，為試驗的清洗和表面消毒帶來了不便。通過對蕨菜莖段表面進行洗刷，能夠有效地實施表面消毒，降低污染率。然而洗刷不當會傷害外植體的表皮，使75%乙醇、HgCl2更容易進入體內而破壞內部組織，從而引發外植體死亡。試驗用柔軟毛筆洗刷，則基本不會傷害外植體的表皮，能有效地完成表面消毒，達到一定的試驗消毒效果，使蕨菜莖段的污染率比不洗刷的對照降低了5.0個百分點，成活率也比對照有所提高。而試管刷洗刷的處理由于刷上的毛較硬，容易刷傷外植體表皮，雖然該處理污染率最低，僅為11.7%，但成活率只有51.7%，比毛筆洗刷處理的66.7%成活率下降了15.0個百分點。

綜合污染率和成活率來考慮，蕨菜莖段在組織培養中用柔軟毛筆對每根蕨菜莖段表面洗刷1 min，再用75%乙醇消毒15 s，接著用1.0 g/L HgCl2溶液消毒5 min，則污染率為15.0%，成活率達66.7%，消毒效果在試驗范圍內達到了最佳。

參考文獻：

[1] 王正華，趙 梅，楊 華，等.野生蕨菜的馴化栽培及加工[J]. 加工與貯藏，2006（2）：40-41.

[2] 王新華，趙恒田，盛慶軍.蕨類山野菜人工繁殖及其研究進展[J].北方園藝，2004（6）：4-6.

[3] 馬 博，蘇仕林，李榮峰.蕨菜化學成分及其生物活性研究進展[J].食品工業科技，2011，32（3）：413-416.

[4] 李榮峰，蘇仕林，馬 博.野生蕨菜的采后生理變化及保鮮技術研究[J].百色學院學報， 2010，23（6）：90-93.

[5] 趙守訓，秦 康，丁志遵，等.中藥辭海（第三卷）[M]. 北京：中國醫藥科技出版社，1997.1443.

[6] 劉艷霞，馬衛東.蕨菜及其栽培技術[J]. 河南農業科學，2001（6）：39-41.

[7] 方利娟，蘇仕林. 蕨菜的價值及其開發利用[J]. 現代農業科技，2005（15）：124-127.

[8] DOUGLAS G E. A new technique for the culture of fern gametophytes[J]. Plant Cell Reports，1990，8（10）：632-634.

[9] 馬 博，李榮峰，潘治成.蕨菜快速繁殖研究[J].百色學院學報，2010，23（3）：90-93.

[10] 方利娟，蘇仕林，李榮峰. 蕨菜的人工繁殖技術初報[J].農技服務，2010，27（2）：207-208.

[11] 賴玉潔，路丙社，陳書明，等.青榨槭外植體消毒方法初步研究[J]. 河北林果研究，2007，22（2）：143-145，158.

[12] 肖顯華，王順珍，藏林榮，等.植物材料表面消毒方法的改進[J].生物技術，1999，9（1）：43-45.

[13] 王利民，周 毅，陳龍友，等.植物組織培養中消毒劑的運用[J].貴州師范大學學報（自然科學版），2002，20（1）：15-17.