響應面法優化煙草游離煙堿的提取工藝研究

摘要： 為研究提取因素對煙草中游離煙堿的提取得率的影響。在單因素試驗基礎上，選擇提取溶劑中液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉速，進行4因素3水平Box-Behnken試驗設計，采用響應面法（RSM）分析了4個因素對響應值（游離煙堿得率）的影響。結果表明，水提取-有機溶劑萃取法提取煙草中游離煙堿的最優條件如下： 液料比30∶1（V/m，mL/g），提取時間33 min，搖床轉速212 r/min和提取溫度34 ℃。在最優的條件下進行了5次驗證試驗，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與理論值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%，說明該優化方法可行。

關鍵詞：煙草；游離煙堿；提取；響應面優化

中圖分類號：S572 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3922-04

煙堿是煙草中的一種特殊的生物堿，以游離態、質子態兩種形態存在[1]。卷煙的品質和勁頭不僅與煙草及主流煙氣中的煙堿總含量有關，與煙堿形態也有著密切的關系，游離態煙堿易揮發，主要以氣相形態存在，易于穿透口腔黏膜從而更快速地被人體吸收，能對中樞神經產生強烈的作用，抽吸時具有較強的勁頭[2，3]，而質子態煙堿被口腔吸收的相對慢一點，抽吸時勁頭較弱。所以針對不同形態的煙堿進行研究和測定是十分必要的。

煙草中煙堿與有機酸結合所形成的鹽類為極易解離的弱酸弱堿鹽，因而要準確測定煙草中游離態煙堿的絕對含量有一定的難度，其提取方法是至關重要的[4]。目前煙草中游離煙堿含量的提取和測定方法各異，測定結果也有所不同，為得到一個穩定而準確的可以用于長期檢測的方法，筆者根據前期試驗和參考文獻[5，6]，利用響應面法[7]優化了煙草游離煙堿提取條件，旨在為煙草煙堿形態對煙草品質的影響提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙堿（純度大于98%，0 ℃下保存）；正十七烷（純度大于99%，New Jersey USA）；三氯甲烷（色譜純，北京化工廠）；氫氧化鈉（AR，天津市科密毆化學試劑開發中心）；煙葉（石家莊卷煙廠提供）；BS-4GBS-4G全溫振蕩培養箱（江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司）；6890GC/5973MS氣質聯用儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試驗方法

煙草中游離煙堿的測定[5]：稱取約1 g樣品，放入150 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL用0.01 mol/L的NaOH水溶液調節至pH 7.00的去CO2蒸餾水，在室溫下振蕩萃取0.5 h，過濾，取濾液15 mL至250 mL分液漏斗中，用三氯甲烷（含內標： 正十七烷）萃取2次，每次20 mL，合并有機相，作為氣相色譜分析。采用內標-工作曲線法對氣相色譜鑒定出的游離煙堿進行定量。

1.3 響應曲面（RSM） 試驗設計

1.3.1 單因素試驗 按文獻[5]考察液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉速等因素對游離煙堿提取率的影響。

1.3.2 響應面分析法試驗設計 根據筆者前期試驗[5]，選取液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉速為關鍵影響因子， 采用Box-Behnken設計，因子水平及編碼見表1。以游離煙堿得率為評價指標。數據分析及模型建立由Design Expert （Version 7.1.3）軟件完成。該模型利用最小二乘法擬合響應值與自變量之間的關系方程： y=B0+B1x1+B2x2+B3x3+B4x4+B12x1x2+B13x1x3+B14x1x4+B23x2x3+B24x2x4+B34x3x4+B11x12+B22x22+B33x32+B44x42，式中：y為響應值， B0為常數項，B1、B2、B3、B4分別為線性系數，B12、B13、B14、B23、B24、B34為交互項系數，B11、B22、B33、B44為二次項系數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

通過單因素試驗結果可知，當液料比為30∶1、時間為30 min、溫度為40 ℃、搖床轉速為200 r/min時，游離煙堿的提取效果較好。

2.2 響應面分析試驗結果

2.2.1 多元二次方程的建立 根據單因素的液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉速4個單因素試驗結果，確定響應面試驗各因素的水平范圍。采用Design-Expert軟件為輔助手段設計響應面試驗，選用Box-Behnken模型（BBD）設計進行了29組試驗，其結果見表2。

2.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert7.1.3軟件，通過表2中游離煙堿提取率試驗數據進行多元回歸擬合，獲得游離煙堿提取率對編碼自變量液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉速的二次多項回歸方程：

y=6.77+0.18x1+0.029x2+0.10x3-0.67x4+0.073x1x2+0.18x1x3-0.36x1x4-0.37x2x3+0.13x2x4-0.39x3x4-0.60x12-0.36x22-0.53x32-0.80x42

對上述回歸模型進行方差分析，結果表明，總回歸達到極顯著水平，說明本試驗與所選因素之間存在極顯著的回歸關系，試驗設計方案正確。

由表3可以看出，該模型F=32.39，P<0.01，表明模型極顯著，不同處理可導致不同的響應。失擬項F=4.71，P=0.072 4，模型失擬不顯著。模型的決定系數R2=0.963 0，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著；而調整決定系數R2=0.926 0，說明響應值的變化有92.6%來源于所選變量，即液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉速。因此，該回歸方程對試驗擬合情況較好，試驗誤差小，可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。

從系數項的P值來分析，方程的一次項（x1、x4）、二次項（x12、x22、x32、x42）、交互項（x1x4、x2x3、x3x4）都達到極顯著水平（P<0.01），說明各具體試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。游離煙堿提取率與試驗因子之間存在極顯著的回歸關系，其優化的方程為：

y=6.77+0.18x1-0.67x4-0.36x1x4-0.37x2x3-

0.39x3x4-0.60x12-0.36x22-0.53x32-0.80x42

通過游離煙堿提取率的二次多項數學模型解逆矩陣，得最優萃取工藝條件：提取時間33.17 min、液料比29.36∶1、搖床轉速212.46 r/min和提取溫度34.49 ℃。在此條件下，游離煙堿提取率理論值可達6.98 mg/g?？紤]到實際操作的局限性，同時達到節省時間、節約試劑、萃取效果好的目的，將游離煙堿提取工藝條件修正為：提取時間33 min、液料比30∶1、搖床轉速212 r/min和提取溫度34 ℃。在此條件下再次進行5次平行驗證試驗，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與理論值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%，兩者吻合較好， 說明模型可行。

2.2.3 游離煙堿提取工藝的響應面交互作用分析與優化

由回歸方程所作的響應曲面圖及其等高線圖如圖3、圖4、圖5所示。通過該組動態圖可評價試驗因子對游離煙堿提取率的兩兩交互作用，以及確定各個因素的最佳水平范圍。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[7]。

由圖3、圖4、圖5可知，搖床轉速、液料比是影響游離煙堿提取率的最顯著因素，表現為等高曲線陡峭；提取溫度和提取時間次之，表現為等高曲線較平滑，說明提取溫度和提取時間對響應值影響較小。

由圖3 可知， 在溫度為30～42 ℃時，提取時間為24～40 min 時，游離煙堿提取率較大。提取時間比溫度對游離煙堿提取量的影響大。隨著提取時間的增大，游離煙堿提取量在不斷增大，當提取溫度在一定范圍內（<42 ℃），游離煙堿提取量隨著時間的增加不斷增大，而當溫度繼續增大時，游離煙堿提取率反而減少。

由圖4可知， 在轉速為170～235 r/min時，液料比為（26～34）∶1 （mL∶g） 時，游離煙堿提取率較大。轉速較液料比對游離煙堿提取量的影響大。隨著轉速的增大，游離煙堿提取量在不斷增大，當提取轉速在一定范圍內（<170 r/min），游離煙堿提取量隨著液料比的增加不斷增大， 而當轉速繼續增大時，游離煙堿提取率反而減少。

由圖5可知， 在轉速為160～250 r/min時， 溫度為30～44 ℃時， 游離煙堿提取率較大，可達6.496 6 mg/g以上。轉速比溫度對游離煙堿提取量的影響大。隨著轉速的增大，游離煙堿提取量不斷增大，當轉速在一定范圍內（<160 r/min），游離煙堿提取量隨著溫度的增加不斷增大，而當轉速繼續增大時，游離煙堿提取率反而減少。

3 結論

1）在單因素試驗的基礎上，將響應面法應用于優化水-有機溶劑提取煙草中游離煙堿的條件?；貧w分析結果表明，搖床轉速和液料比對游離煙堿得率的影響顯著；時間與溫度，轉速和液料比，轉速和溫度的交互項對游離煙堿得率影響高度顯著。

2）游離煙堿得率響應方程的回歸分析和驗證試驗表明本研究方法合理可行。用水-有機溶劑從煙草中提取游離煙堿的最佳條件為液料比30∶1，提取時間33 min，搖床轉速212 r/min和提取溫度34 ℃，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與預測值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%。

參考文獻：

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