廣西莪術多糖水提工藝優化及不同產地多糖含量測定

摘要：為了優化廣西莪術多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）的水提工藝條件，以CKP含量為評價指標，采用正交試驗考察料水質量比、提取溫度、提取時間3個因素對CKP含量的影響并獲得各條件的最佳組合。以6個產地CKP含量為考察指標，采用優化的水提工藝條件提取CKP，用H2O2水浴脫色，用Sevage法除蛋白質，用苯酚-硫酸比色法在490 nm波長下測定CKP含量。結果表明，最佳的水提工藝條件為料水質量比1∶5、在70 ℃下水提1.5 h，在此條件下，CKP平均含量為0.073 mg/g。6個不同產地CKP含量的差異較大，上思縣思陽鎮的CKP含量最高，為0.073 mg/g，橫縣南鄉鎮的CKP含量最低，為0.031 mg/g。正交試驗優選的CKP水提工藝條件是科學可行的，廣西境內不同產地的CKP含量存在差異，可為廣西莪術的資源利用和質量控制提供理論依據。

關鍵詞：廣西莪術多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）；正交試驗；水提工藝；不同產地

中圖分類號：TQ461；R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3947-04

廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）是2010年版《中華人民共和國藥典》收載的3種基原莪術中的一種，為姜科姜黃屬植物的干燥根莖，為廣西的地道藥材[1]。莪術的主要有效部位為根和根莖，莪術的主要活性成分是揮發油和多糖[2]。莪術揮發油具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血等作用，已廣泛應用于臨床。目前有關廣西莪術的研究主要集中在莪術油的藥效物質基礎和臨床應用開發上，有關廣西莪術多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）的研究報道較少[3，4]，對CKP的提取工藝及不同產地的CKP含量的研究目前尚未見文獻報道。而大量的研究證實，CKP具有多方面的藥理活性，包括降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化和抑菌等作用[5，6]。因此本研究采用正交試驗，以CKP含量為檢測指標，對廣西莪術中多糖水提工藝進行優化，篩選出CKP的最佳水提工藝，在此基礎上對不同產地的CKP含量進行比較研究，為廣西莪術的生藥品質評價和開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-2401PC 型紫外可見分光光度計購自日本島津公司，FW177型中草藥萬能粉碎機購自天津市泰斯特儀器有限公司，SHJM-1型數顯恒溫攪拌電熱套購自山東省鄄城現代實驗儀器廠，Hei-VAP型旋轉蒸發儀購自德國Heidolph公司，80-1型電動離心機購自江蘇省金壇市城西曉陽電子儀器廠，電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.1.2 原料 于2011年11～12月，在廣西境內全面野外調查的基礎上，采集了有代表性的6個產地的廣西莪術（玉林市樟木鎮、賓陽縣新賓鎮、橫縣南鄉鎮、上思縣思陽鎮、靈山縣陸屋鎮、玉林市成均鎮）作為CKP的試驗材料。所有樣品經桂林醫學院生藥學教研室曾建紅教授鑒定為姜科姜黃屬植物廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）的根莖。采收后將根莖除去雜質、去皮、洗凈，晾干備用。

1.2 方法

1.2.1 水提工藝正交試驗 根據浸提理論與實踐經驗，CKP的水提工藝與料水質量比、提取溫度和提取時間等因素密切相關[7]。為選擇最佳的水提工藝條件，本試驗采用L9（34）正交試驗，以產于上思縣思陽鎮的樣品為試驗材料，以CKP提取率為考察指標，因素與水平見表1。

1.2.2 CKP含量的測定

1）供試品溶液的制備。稱取廣西莪術鮮品100 g，切成片狀，置于1 000 mL圓底燒瓶中，按料水質量比1∶5加入去離子水，在70 ℃浸提1.5 h，過濾，重復浸提3次，合并濾液，于60 ℃真空濃縮至150 mL。將30 mL 30% H2O2加入濃縮液中，水浴脫色2.5 h，液體顏色變為淡黃色后迅速加熱，除去H2O2，加入去離子水將溶液定容至100 mL。采用Sevage法除去蛋白質[8]后，采用傾析法取上清液少許，加入1 mL 2 g/L茚三酮溶液，加熱煮沸1 min，若無紫色出現，說明大部分蛋白質已經被除去。然后采用傾析法取上清液，加去離子水定容至100 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2）標準品溶液的制備。精密稱取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為0.10 mg/mL的標準品溶液。

3）最大吸收波長的選擇。取上述標準品溶液和供試品溶液各1 mL，分別置于具塞刻度試管中，各加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，混勻，再迅速各加濃硫酸5.0 mL，充分搖勻，放入-4 ℃冰箱中冷卻。另取1 mL的去離子水同上平行操作制得空白對照液。在300～700 nm范圍內掃描，以期找到吸收峰最大的吸收波長。

4）標準曲線的繪制。精密吸取標準品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取各溶液1 mL，置于具塞刻度試管中，加入50 g/L苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加濃硫酸5 mL，充分搖勻，放入-4 ℃冰箱冷卻。另取1 mL的去離子水同上平行操作制得空白對照液。在490 nm波長處測量其吸光度，以濃度（x）對吸光度（y）進行線性回歸，制得標準曲線。按所得標準曲線計算樣品CKP含量。

1.2.3 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液1.0 mL，在0、2、4、6、12、24 h內，于490 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 精密度試驗 分別精密吸取標準品溶液6份，每份1.0 mL，在490 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 重復性試驗 取同一批號的廣西莪術鮮品6份，每份約100 g，切成片狀，平行制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液1.0 mL，在490 nm波長處測定吸光度。

1.2.6 加樣回收率試驗 分別稱取已知CKP含量的廣西莪術鮮品6份，每份約50 g，分別加入一定量的標準品溶液，制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液1.0 mL，在490 nm波長處測定吸光度，計算回收率，回收率=（測得量-樣品質量）/標準品加入量×100%。

1.2.7 不同產地CKP含量的測定 取6個產地的廣西莪術鮮品，每個產地分別取3份，每份約100 g，切成片狀，樣品按最佳工藝條件提取，制備供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，在490 nm波長處測定吸光度，按回歸方程計算CKP含量。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇結果

在300～700 nm范圍內掃描發現，標準品溶液、供試品溶液均在490 nm處有最大吸收峰，故選擇490 nm為測定波長。

2.2 標準曲線的繪制

標準品的標準曲線見圖1。標準曲線的回歸方程為：y=0.012 6x+0.229 0，r=0.999 1（n=6），葡萄糖在0.143～2.857 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3 穩定性試驗、精密度試驗、重復性試驗和加樣回收率試驗結果

穩定性試驗中吸光度的相對標準偏差為2.16%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。精密度試驗中吸光度的相對標準偏差為0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。重復性試驗中吸光度的相對標準偏差為1.73%（n=6），表明本試驗方法重復性良好。加樣回收率試驗的平均回收率為101.9%，相對標準偏差為3.11%（n=6），表明該方法的回收率較好，結果見表2。

2.4 水提工藝優化結果

2.4.1 正交試驗結果 由方差分析結果可知，料水質量比、提取時間、提取溫度3個因素3個水平對CKP含量均有顯著性影響（P<0.05）。由表3可知，各因素對CKP含量影響為料水質量比>提取時間>提取溫度，水提多糖的最佳工藝條件為A1B2C1，即料水質量比1∶5，提取溫度70 ℃，每次提取1.5 h。

2.4.2 最佳工藝條件的驗證結果 以產于上思縣思陽鎮的樣品為試驗材料，按優選的水提工藝條件進行了3次驗證試驗，即按料水質量比1∶5加去離子水，在70 ℃加熱回流提取1.5 h。3次驗證試驗的CKP含量分別為0.071、0.075、0.074 mg/g，CKP平均含量為0.073 mg/g，相對標準偏差為3.27%。說明優選的水提工藝條件穩定、合理、可行。

2.5 不同產地CKP含量的測定結果

由表4可知，CKP含量從高到低的產地依次為上思縣思陽鎮、靈山縣陸屋鎮、玉林市樟木鎮、玉林市成均鎮、賓陽縣新賓鎮、橫縣南鄉鎮。6個不同產地的CKP含量存在差異。

3 小結與討論

目前，對于廣西莪術的研究和利用主要集中在莪術油的基礎研究和臨床研究上，而對于含量較高的莪術多糖的研究較少，因此，開展廣西莪術多糖的研究具有較廣闊的前景。影響中藥浸提的因素很多，包括粉碎度、提取溫度、提取時間、濃度、pH、溶劑量、壓力等[9]。植物多糖提取率受提取時樣品的狀況和提取條件等的影響。提取植物多糖時，當提取液達到一定溫度時，多糖會從藥材浸出，但仍有一部分多糖在細胞內難以浸出，選擇適宜的料水質量比可以促使多糖浸出，浸出后的多糖一部分擴散，一部分可能仍然吸附在藥材表面，因而選擇適宜的提取時間和提取溫度，可以使多糖擴散達到平衡[10]。正交試驗設計是一種高效、快速、經濟的試驗設計方法，是通過多因素多水平來優化的試驗設計方案。本研究對料水質量比、提取溫度、提取時間3個因素在3個水平上考察了它們對CKP含量的影響，設計了三因素三水平的正交表進行試驗，大大節省了時間和材料，且結果有代表性，易進行統計學分析。

產地環境和植物本身的遺傳特性是影響多糖含量的主要因素，采樣季節和多糖提取工藝也會影響多糖含量的測定結果[11]。本試驗對廣西6個不同產地的CKP含量進行研究，結果表明，上思縣思陽鎮的CKP含量最高，平均含量高達0.073 mg/g，橫縣南鄉鎮的CKP含量最低，平均含量為0.031 mg/g，表明廣西境內不同產地的CKP含量差異較大，產地對CKP含量的影響較大。由于上思縣思陽鎮的CKP含量遠高于其他產地，在廣西莪術的規模化生產中，建議選用上思縣思陽鎮的廣西莪術作為優良種質，以保證和提高廣西莪術的藥材質量。同時還要注意到，這種相近產區不同產地主要活性成分的無地理規律的變異模式[12]，是由于每個產區取樣過少產生的還是確實反映了CKP含量變異的本質，需要從遺傳學、栽培歷史和生態學等方面進一步探討。

總之，本研究以CKP含量為考察指標，通過正交試驗優選出了影響多糖提取率的主次關系依次是料水質量比>提取時間>提取溫度。根據正交試驗得出最佳工藝條件為料水質量比1∶5、在70 ℃下水提1.5 h，在此工藝條件進行提取可使CKP含量達到0.073 mg/g。正交試驗優選的水提工藝條件的驗證結果表明，所測得的CKP含量穩定，工藝方法合理可行，為下一步的研究和開發利用提供了依據。不同產地的CKP含量的比較結果表明，不同產地的CKP含量的差異較大，為廣西莪術藥材產地的選擇及質量控制方法提供了一定的依據。

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