紫蘇蛋白質提取工藝優化

摘要：以脫脂紫蘇（Perilla frutescens）葉和莖為原料，采用堿溶酸沉法制備紫蘇蛋白質。通過單因素試驗和正交試驗研究并優化紫蘇蛋白質的提取工藝條件。結果表明，紫蘇蛋白質的最佳制備工藝條件為堿提pH 8.0、料液比1∶10（m/V，g∶mL）、堿提溫度40 ℃、酸沉pH 4.0，在此條件下，紫蘇蛋白質提取率為20.51%；在最佳工藝條件下，采用100 W的超聲波輔助提取，蛋白質提取率為22.41%。

關鍵詞：紫蘇（Perilla frutescens）；堿溶酸沉法；蛋白質提取工藝

中圖分類號：TQ936.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3951-03

紫蘇（Perilla frutescens）是一種獨特的油料保健作物，含油率一般為30%～51%，粗蛋白含量約為20%～23%，主要用于榨取紫蘇油[1]。隨著紫蘇的大面積種植和紫蘇產品的開發利用，人們對紫蘇的研究范圍越來越廣泛。目前對紫蘇成分的研究主要集中在紫蘇氨基酸組成、藥理作用、產品的開發利用等方面，而對于紫蘇蛋白質分離提取的研究卻少有報道，紫蘇中含有大量的蛋白質卻未被好好地加以利用。紫蘇中的氨基酸組成比較全面，種類達18種，除含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）偏低外，其他氨基酸組成與其他植物沒有差別[2，3]。紫蘇作為一種新興的植物蛋白質資源，研究其提取工藝是有效開發利用紫蘇蛋白質的前提條件。試驗以用石油醚脫脂后的紫蘇葉以及莖為原料，采用單因素試驗和正交試驗研究紫蘇蛋白質提取的最佳提取工藝條件，充分利用了紫蘇中的蛋白質，為進一步開發利用紫蘇資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 紫蘇由中華大藥房提供，蛋白質含量為27.8%。牛血清白蛋白（BSA），95%的乙醇，85%的磷酸，考馬斯亮藍溶液，石油醚（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、濃鹽酸等（分析純）。

1.1.2 儀器與設備 PHS-3C型數顯酸度計、TDL-40B臺式離心機、22型可見光分光光度計、SHZ-D（Ⅲ）循環式真空泵、TDA溫度控制儀（恒溫水浴鍋）、電熱恒溫干燥箱、FA2104S電子分析天平、容量瓶等。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 以牛血清白蛋白（BSA）為標準蛋白質繪制標準曲線[4]。標準蛋白質溶液：稱取0.25 g牛血清白蛋白溶于25 mL去離子水中，即為10 mg/mL的原液。考馬斯亮藍G-250試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250試劑，溶于50 mL 95%的乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，最后用去離子水定容到1 000 mL。取7支試管，使蛋白質濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 mg/mL，向每支試管中加入5 mL考馬斯亮藍溶液，靜置2 min后測定各組蛋白質溶液的吸光度，并記錄數據。

1.2.2 紫蘇葉分離蛋白的制取工藝 干紫蘇葉→低溫冷凍→研磨→加石油醚脫脂→濾渣→自然風干→加堿浸提→過濾、離心→蛋白質提取液→酸沉→水洗中和沉淀→干燥→粗蛋白[5]。

1.2.3 蛋白質提取率的計算 蛋白質提取率=分離的蛋白質的質量/原料的質量×100%。

1.2.4 超聲波對紫蘇蛋白質提取率的影響 在最佳工藝條件下，將裝有溶液的小燒杯放在100 W、50 ℃下超聲波清洗器中振蕩提取30 min，確定超聲波對紫蘇蛋白質提取率的影響。

1.2.5 單因素試驗 ①堿提pH對紫蘇蛋白質提取率的影響。準確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15（m/V，g∶mL）的料液比分別加入pH 7.0、8.0、9.0、10.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下攪拌浸提30 min，后將溶液進行抽濾得濾液，將濾液用1 mol/L的HCl溶液沉淀靜置30 min，再離心得粗蛋白，烘干后再稱量，考察最佳堿提pH對蛋白質提取率的影響。②料液比對紫蘇蛋白質提取率的影響。準確稱取1 g脫脂紫蘇葉，分別按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m/V，g∶mL，下同）的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下制備粗蛋白，獲得料液比對蛋白質提取率的影響。③堿提溫度對紫蘇蛋白質提取率的影響。準確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，分別在堿提溫度為30、40、50、60 ℃的條件下制備粗蛋白，研究堿提溫度對蛋白質提取率的影響。④酸沉pH對紫蘇蛋白質提取率的影響。準確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下攪拌浸提30 min，在pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0的條件下制備粗蛋白，研究酸沉pH對蛋白質提取率的影響。

1.2.6 正交試驗 在上述單因素試驗的基礎上進行四因素三水平正交試驗，以溶液中蛋白質提取率作為衡量指標，研究采用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質的最佳工藝條件，因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 牛血清白蛋白標準曲線的繪制

試驗過程中在波長為595 nm下測得蛋白質濃度與吸光度的關系見表2。依此繪制牛血清白蛋白標準曲線（圖1），得到標準方程為■=0.051 4x+0.055 9，r=0.990 4。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 堿提pH對紫蘇蛋白質提取率的影響 由圖2可知，隨著pH的增加，蛋白質提取率先增加。當溶液的pH為9.0時，紫蘇葉分離蛋白質的提取率為16.23%，達到最大。此后再增加提取液的pH，蛋白質提取率降低。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質的最佳堿提pH為9.0。

2.2.2 料液比對紫蘇蛋白質提取率的影響 由圖3可知，隨著料液比的減小，蛋白質提取率先增加后降低。合適的料液比可降低體系的黏度、增大濃度梯度、加快傳質過程，因而提取率高；但料液比過低，紫蘇葉分離蛋白質的提取率并沒有明顯增加，反而會增加后處理的負擔。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質的最佳料液比為1∶15。

2.2.3 堿提溫度對紫蘇蛋白質提取率的影響 由圖4可知，在一定的堿提溫度范圍內，隨著堿提溫度升高，紫蘇蛋白質的提取率也隨之升高，50 ℃時提取率最高，為16.22%，但是當堿提溫度超過50 ℃，蛋白質的提取率反而下降。因為堿提溫度越高，越有利于蛋白質的溶出，當堿提溫度超過50 ℃，由于淀粉糊化作用反而會降低蛋白質的提取率；另外，堿提溫度過高容易使蛋白質發生變性，影響最終產品的特性。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質的最佳堿提溫度為50 ℃。

2.2.4 酸沉pH對紫蘇蛋白質提取率的影響 由圖5可知，酸沉階段紫蘇蛋白質的提取率隨pH的增加呈先增大后減小的趨勢，在pH 5.0時提取率達到最大。蛋白質是兩性電解質，在某一種pH的溶液中，它所帶的正電荷數與負電荷數恰好相等，即凈電荷數為零，此時蛋白質間靜電荷排斥作用最低，蛋白質聚集、沉淀，溶解度最低，從溶液中析出。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質的最佳酸沉pH為5.0。

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表3。由表3可知，各因素對紫蘇蛋白質提取率的影響主次為料液比>酸沉pH>堿提溫度>堿提pH，即在堿提過程中料液比影響最大，其次為酸沉pH和堿提溫度，堿提pH對提取率的影響最小。從試驗結果來看，最優組合為A1B1C1D1。綜合各因素的作用，得出適于本工藝的最佳浸提條件是堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0。在上述條件下蛋白質提取率可達到20.51%。

2.4 超聲波對蛋白質提取率的影響

采用紫蘇葉分離蛋白質的最佳提取工藝條件為堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在浸提過程中增加100 W的超聲波振蕩提取，做兩組平行試驗，紫蘇葉分離蛋白質的提取率最高可達22.41%。超聲波的“空化效應”增加了紫蘇蛋白質的提取率；超聲波引起溶劑的機械振動，可以加快熱傳遞，使溶劑受熱均勻，使溶質整體受熱均勻，同時加快了溶質分散，也加快了溶解。

3 結論

影響紫蘇中蛋白質提取率的因素的影響程度由大到小依次是料液比、酸沉pH、堿提溫度、堿提pH。其中堿提溫度、料液比和酸沉pH對蛋白質提取率影響顯著，堿提pH對紫蘇葉中蛋白質的提取率影響不顯著。紫蘇葉蛋白質的最佳提取條件是堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在此條件下蛋白質提取率可達到20.51%。在提取過程中添加100 W的超聲波處理會明顯增加蛋白質的提取率，此條件下紫蘇蛋白質的提取率可達到22.41%。

參考文獻：

[1] 盛彩虹，程素嬌，劉 曄，等.紫蘇分離蛋白的制備工藝研究[J]. 中國油脂，2011，36（6）：32-35.

[2] 張燕平，張 虹，沈志揚.蘇子油粕中蛋白質的提取研究[J]. 中國商辦工業，2000（7）：46-48.

[3] 張 洪，黃建韻，趙東海.紫蘇營養成分的研究[J].湖南文理學院學報（自然科學版），2006，22（1）：41-43.

[4] 魯晶晶，鄭喜群，劉曉蘭，等.堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白的工藝優化[J].食品工業科技，2011，32（10）：321-324.

[5] 徐建國，胡青平，王迎籽，等.堿溶酸沉法提取桑椹籽蛋白質的工藝優化[J].中國糧油學報，2010，25（6）：104-108.