梅花星豬類群種質分子特征研究

摘要：利用PCR-RFLP等技術檢測了湖北省黃梅縣梅花星類群49頭豬的ESR、FSHβ（影響產仔數）、 TEF1（生長速度）、LPIN1、H-FABP（肌內脂肪含量），MC4R、CMYA1（背膘厚度）等7個候選基因的多態性。結果表明，梅花星豬類群中上述7個候選基因均有豐富的多態性，特別是肌內脂肪含量有利基因的基因頻率較高，是其肉質優良的分子基礎。其他性狀相關基因的雜合子頻率也較高，通過和已有的研究對比，初步分析梅花星豬類群受外來豬雜化程度嚴重，本研究為梅花星豬遺傳資源的保護和利用提供了科學依據。

關鍵詞：梅花星豬；產仔數；生長速度；背膘厚度；肌內脂肪含量；候選基因

中圖分類號：S828.8+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3995-04

中國地大物博，有著豐富的自然氣候和多樣的地形地貌，各個地方的經濟情況與市場差異大，對種豬產生了不同的需求，對外部形態和生產性能的人工選擇標準不一，加上飼料與飼養管理條件上的差別，從而形成了與當地生態環境社會經濟相適應的眾多地方品種。

20世紀80年代的中國生豬品種調查發現，梅花星豬產于華北和華中地區之間的過渡地帶，主產于湖北省黃梅縣和陽新縣一帶，湖北的武穴市及蘄春縣、安徽省的宿松縣和江西省的瑞昌縣、武寧縣也有分布。其頭型主要呈現“象鼻頭”，有的豬在額、鼻、尾間、下腹及四肢下端有白毛，其中額部的一小撮是梅花狀白毛，故被稱之為“梅花星豬”。與中國地方品種一樣，具有耐粗飼、抗逆性強、繁殖率高、肉質細嫩香醇等優點。1982年，專家赴產區考察，認為主產陽新的“陽新豬”和主產黃梅的“梅花星豬”屬同一品種，并定名為陽新豬。梅花星豬實際上成為了陽新豬的一個類群。近些年來，由于外三元商品豬迅猛發展的沖擊，位于黃梅縣的梅花星豬保種場名存實亡，梅花星豬的生存受到重挫，瀕臨滅絕[1，2]。黃梅縣五祖鎮的黃梅強立畜牧有限公司歷經2年多的努力，從黃梅、宿松、蘄春、柳林等各鄉鎮收集了100多頭梅花星豬，從而形成了一定規模的梅花星豬保種群體。

本研究采集了梅花星豬類群中有明顯品種特征的49頭豬個體的耳組織樣品， 對與產仔數（ESR、FSHβ）、生長速度（TEF1）、肌內脂肪含量（LPIN1、H-FABP）和背膘厚度（MC4R、CMYA1）相關的主要候選基因的多態性進行了檢測和分析。從分子水平對梅花星豬進行了種質特性的評估，為該豬種的保護和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和基因組DNA提取

采集黃梅縣五祖鎮黃梅強立畜牧有限公司的梅花星豬類群中有明顯品種特征的49頭個體的耳組織。加入75%乙醇， -20 ℃保存備用。酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.2 試劑與材料

TaqⅠ、HinfⅠ、BshNⅠ、PvuⅡ限制性內切酶，DL 2000 DNA Marker等購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物設計

ESR、FSHβ、TEF1、LPIN1、H-FABP、MC4R、CMYA1基因的引物如表1所示。

1.4 PCR擴增

PCR反應總體積是10 μL，體系如下：50 ng的基因組DNA，1×PCR Buffer（含Mg2+，TaKaRa），引物終濃度為0.3 μmol/L，dNTPs終濃度為75 μmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U。PCR擴增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s（具體退火溫度見表1），72 ℃ 10～90 s（具體延伸時間根據目的片段長度確定，詳情見表1），34個循環；最后72 ℃繼續延伸5 min。

1.5 多態性檢測

FSHβ等位基因由片段插入造成， 瓊脂糖電泳檢測PCR 產物即可見多態性。其他6個基因均采用PCR-RFLP 方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 ESR基因

由圖1可知，ESR基因出現了3種基因型。121 bp純合子（AA基因型）；121、 65、56 bp雜合子（AB基因型）；65、56 bp純合子（BB基因型）。梅花星豬類群ESR基因多態性檢測結果見表2所示。

2.2 FSH β基因

由圖2可知，FSHβ基因有3種基因型，500 bp純合子（AA基因型）；500、220 bp雜合子（AB基因型）；220 bp純合子（BB基因型）。梅花星豬類群FSHβ基因多態性檢測結果如表2所示。

2.3 TEF1基因

由圖3可知，TEF1基因有3種基因型，分別為93 bp純合子（GG基因型）、93、118 bp雜合子（AG基因型）、118 bp純合子（AA基因型）。梅花星豬類群TEF1基因多態性檢測結果如表2所示。

2.4 Lpin1基因

由圖4可知，Lpin1基因有3種基因型，分別為316 bp純合子（TT基因型）；316、256 bp雜合子（TC基因型）；256 bp純合子（CC基因型）。梅花星豬類群Lpin1基因多態性檢測結果如表2所示。

2.5 H-FABP基因

由圖5可知，H-FABP基因經PCR-RFLP分型后，純合子TT和CC片段大小分別為（319+172+59） bp和（319+231+59） bp，雜合子CT為319 bp和（231+172+59）bp。梅花星豬類群H-FABP基因多態性檢測結果如表2所示。

2.6 MC4R基因

MC4R基因采用PCR-RFLP進行分型檢測，結果出現3種基因型（圖6）：480 bp純合子（AA基因型）；480、400 bp雜合子（AB基因型）；400 bp純合子（BB基因型）。梅花星豬類群MC4R基因多態性檢測結果如表2所示。

2.7 CMYA1基因

CMYA1基因經PCR-RFLP分型檢測，結果有3種基因型：CC型有4條帶（444+254+206+85）bp，TT型有5條帶（286+254+206+158+85） bp，CT型有6條帶（444+286+254+206+158+85） bp（圖7）。CMYA1基因多態性檢測結果如表2所示。

3 討論

3.1 Lpin1、H-FABP基因

Lpin1基因是與動物機體脂肪沉積密切相關的重要候選基因。豬Lpin1基因第2外顯子存在C93T突變，可用TaqⅠ酶切分型，對于該位點，已有研究表明，在萊蕪豬、沂蒙豬、杜洛克、大白和長白豬中CC型均為優勢等位基因[3，4]。

H-FABP基因參與脂肪酸代謝，調節長鏈脂肪酸攝取與氧化以及能量代謝平衡，位于5′UTR的T/C突變可被HinfⅠ酶識別，Han等[5]在大白和通城品種群體中檢測發現該基因與肌內脂肪含量顯著關聯，TT為有利基因型。

本研究在梅花星豬類群中，對H-FABP基因的檢測結果表明，有利基因型均占到多數，Lpin1基因CC型占到絕大多數，與我國地方豬種優良的肉質性能相吻合，為地方豬種合理開發利用其肉質的優良特性提供了一定的依據。

3.2 ESR、FSHβ基因在群體中的多態性分析

雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR）基因參與并影響著雌激素基因在雌性脊椎動物組織中的表達與調控。Rothschild實驗室采用候選基因法對ESR基因進行RFLPs分析，發現了1個PvuⅡ酶切位點，且等位基因B（含有1條特異的3.7 kb的帶）與高產仔數相關聯，BB基因型個體母豬第一胎總產仔數和產活仔數都比AA（含有1條特異的4.3kb的帶）基因型個體多2.3頭（P<0.01），所有胎次多1.5。

促卵泡激素β亞基（Follicle-stimulating hormone-β，FSHβ）基因，序列的+809與+810堿基之間長度為292 bp，把0.2 kb的擴增產物命名為B等位基因，0.5 kb擴增產物命名為A等位基因。在民豬、約克夏、長白豬和杜洛克豬中擴增出了3種基因型（AA、AB、BB）。其中B等位基因在長白豬和約克夏豬中占優勢，等位基因頻率分別是0.819 6和0.907 4，對其基因效應分析發現BB型母豬比AA型母豬的頭胎平均總產仔數高2.53頭，平均產仔數高2.12頭，所有胎次的平均值高出1.5頭[6]。王繼英等[7]分析了萊蕪豬FSHβ基因的多態性及其與產仔性能的關系，結果表明，對于FSHβ亞基基因，AA基因型占絕對優勢，且產仔數最高。研究發現不同的群體優勢基因型不同，對于國外品種B為有利等位基因，中國地方豬種A為有利等位基因。

對梅花星豬類群檢測結果顯示，ESR基因BB基因型頻率僅為0.08，B基因頻率為0.33。檢測結果與中國地方豬種高產仔性能不符合，而對于FSHβ基因，A、B等位基因頻率基本一樣，未表現某等位基因在梅花星豬群體中占有優勢。兩個基因的檢測結果都說明該群體受到國外豬種影響很大，存在一定的雜化情況。目前的梅花星豬群體系從各個鄉鎮農戶手中收購組建而成，農戶可能用外源豬和本地豬雜交以獲得更快的生長速度。由于群體剛剛組建，后續應該在擴大群體的基礎上，記錄完善各項數據，繼續進行相關分子水平的檢測與選種，以求從遺傳上提純、恢復固有的高產仔性能潛質。

3.3 MC4R、CMYA1基因在梅花星豬類群中的多態性分析

豬MC4R基因第七跨膜結構域一個高度保守區域發生了一個錯義突變（G→A），產生了TaqⅠ酶切位點，這一突變使MC4R蛋白第298位氨基酸的天冬氨酸被天冬酰胺代替（Asp298Asn）。對于MC4R基因該位點，劉桂蘭等[8]在大白豬和梅山豬的雜交家系中檢測顯示AB型為有利基因型，而Kim等[9]對含有中國梅山豬血統的豬群檢測，發現BB型為有利基因型，說明在不同群體中，MC4R基因所引起的性狀變異大小及作用方式是不盡相同的。

CMYA1的主要功能在人與小鼠的研究報道上較多，主要在胚胎發育、肌細胞的成熟、肌管的生產及肌纖維的發育等方面起著重要作用。Xu等[10]對于CMYA1基因Hinf1酶切位點進行了檢測，在通城豬群體檢測結果為CMYA1基因與肩部背膘厚顯著關聯，有利基因型為CC。

對于梅花星豬類群的檢測結果顯示，MC4R基因有利基因型個體占絕大多數，CMYA1基因CC型個體較其他兩種基因型略多。其中雜合子比例都較高，與ESR、FSHβ檢測結果一樣，反映了群體在一定程度上被雜化，有待提純。

3.4 TEF1基因在梅花星豬類群中的多態性分析

TEF1（TEA DNA binding domain-1）基因是重要的轉錄因子，在人和小鼠的心肌和骨骼肌中高表達，缺失后導致心臟缺失和胚胎致死。Xu等[11]在5′UTR區發現G93A突變位點，并通過性狀關聯分析發現該突變位點與平均日增重、腰部背膘厚、三點平均背膘厚和眼肌面積呈顯著關聯。且GG型為有利基因型，G基因為有利等位基因，對于梅花星豬類群TEF1基因檢測顯示，GG型個體占0.4375，而G等位基因比例占到0.656 3，在該群體中比例略有優勢。

本研究限于群體規模限制，數量較少，后續有待擴大規模，并完善數據記錄，繼續進行相關分子水平的檢測。梅花星豬類群是從黃梅縣附近各個鄉鎮收集“梅花星豬”而組建，在收集之前已經被一定程度的雜化，后續需要經過嚴格的性能測定，科學的選種選配，以及配合相關分子水平的檢測，以求恢復群體的遺傳純度，為保護中國地方優良生豬品種提供思路和方法。

參考文獻：

[1] 鄭丕留，張仲葛，陳效華，等.中國家畜家禽品種志[M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[2] 國家畜禽遺傳資源委員會.中國畜禽遺傳資源志·豬志[M].北京：中國農業出版社，2011.

[3] ROTHSCHILD M F， LARSON G R， JACOBSON C D， et al. Pvu Ⅱ polymorphisoms at the porcine estrogen receptor lovus （ESR）[J]. Animal Genetics，1991，22（5）：448.

[4] 戈 新，邢晉諱，劉忠琛，等. 6個豬群lpin1基因多態性分析[J].西南農業學報，2011，24（1）：301-304.

[5] HAN X， JIANG T， YANG H. Investigation of four porcine candidate genes （H-FABP， MYOD1， UCP3 and MASTR） for meat quality traits in Large White pigs[J]. Mol Biol Rep，2012， 39（6）：6599-6605.

[6] 趙要鳳，張 順，李 寧，等.香豬、民豬FSHβ亞基基因位點的多態性分析[J].遺傳，1997，19（增刊）：27-28.

[7] 王繼英，武 英，張大龍，等.萊蕪黑豬高繁基因的多態性及其對產仔數的影響[J].西北農業學報，2008，17（1）：7-10.

[8] 劉桂蘭，蔣思文，熊遠著，等.豬資源家系MC4R基因掃描及其與脂肪性狀的相關分析[J].遺傳學報，2002，29（6）：497-501.

[9] KIM N， LARSEN T， SHORT G， et al.A missense variant of the porcine melanocortin four receptor（MC4R） gene is associated with fatness，growth and feed intake traits[J].Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[10] XU X L，XU X W， PAN P W. Porcine skeletal muscle differentially expressed gene CMYA1： isolation， characterization， mapping， expression and association analysis with carcass traits[J]. Animal Genetics，2009，40（3）：255-261.

[11] XU X W，XING S，DU Z Q，et al. Porcine TEF1 and RTEF1： Molecular characterization and association analyses with growth traits[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，2008，150（4）：447-453.