小麥穎果與根部Cathepsin B—like蛋白的初步研究

摘要：利用免疫組織化學技術觀察了小麥（Triticum aestivum L.）灌漿時期穎果內以及苗期根部原生韌皮部Cathepsin B-like蛋白的分布以及活性變化。結果表明，在開花后1～9 d的小麥穎果內，Cathepsin B-like蛋白主要分布在內果皮細胞以及灌漿池兩側的維管束中；在開花后12～24 d的穎果中，糊粉層內的Cathepsin B-like蛋白含量逐漸增加，兩側維管束細胞中的Cathepsin B-like蛋白消失，穎果背部內果皮細胞的Cathepsin B-like蛋白含量減少并在細胞邊緣出現聚集現象；在小麥苗期根部的原生韌皮部中，隨著韌皮部篩分子的成熟，篩分子內的Cathepsin B-like蛋白含量逐漸下降直至消失。

關鍵詞：Cathepsin B-like蛋白；小麥（Triticum aestivum L.）；穎果；根部；發育

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4044-04

Preliminary Research on Cathepsin B-like Protein in Triticum aestivum L.

Caryopsis and Root

LIU Yanga，ZHOU Zhu-qinga，MEI Fang-zhub，ZHOU Guang-shengb，CAI Jing-tonga，YANG Wen-lia，ZHANG Zhi-huia

（a.College of Life Sciences and Technology；b.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： Immunohistochemical technique was used to observe the distribution and activity variation of cathepsin B-like protein in wheat（Triticum aestivum L.） caryopsis during grain filling period and protophloem of roots during seedling stage. Results showed that in wheat caryopsis 1～9 d after flowering， cathepsin B-like proteins mainly distributed in vascular bundles of endocarp cells and both sides of grouting tank. In caryopsis 12～24 d after flowering， cathepsin B-like protein gradually increased in aleurone layer， while disappeared in both sides of vascular bundles， and reduced in endocarp cells of caryopsis back and concentrated in periphery of cells. In protophloem of roots at seedling stage， cathepsin B-like proteins gradually decreased in sieve elements（SEs） and finally disappeared as SEs matured.

Key words： cathepsin B-like protein； wheat（Triticum aestivum L.）； caryopsis； root； development

收稿日期：2013-02-01

基金項目：國家自然科學基金項目（31171469；31071347）

作者簡介：劉 陽（1985-），男，河南鞏義人，碩士，研究方向為逆境植物細胞生物學，（電話）15527830798（電子信箱）zhuoya472@126.com；

通信作者，周竹青（1965-），男，湖北安陸人，教授，博士，從事作物生理與細胞生物學研究，（電子信箱）zhouzhuqing@mail.hzau.edu.cn。

哺乳動物中廣泛存在著一類被稱作Cathepsin B的蛋白酶[1]，它是木瓜蛋白酶類超家族中的一員[2]，一般存在于動物細胞的溶酶體中[3]。Johnson[4]指出Cathepsin B可能在一些細胞凋亡過程中發揮某種特殊作用。在該類凋亡過程中，常見的Caspase類蛋白無法達到預期目的。Leist等[3]指出Cathepsin B是一種在動植物中高度保守的Papain-like半胱氨酸蛋白酶。Cejudo等[5]在小麥（Triticum aestivum L.）中發現了一個與Cathepsin B蛋白結構具有高度相似性的蛋白質，并在萌發小麥的糊粉層中觀察到了該Cathepsin B-like蛋白對應mRNA的積累，該Cathepsin B-like蛋白受GA調節，其在植物細胞中的作用目前還不確定。但目前為止對灌漿期內小麥穎果以及苗期小麥根部原生韌皮部中Cathepsin B-like蛋白的分布及活性變化尚未見報道。本研究通過對小麥穎果與根部發育過程中Cathepsin B-like蛋白分布以及活性變化進行觀察，以期為小麥發育過程的系統研究進一步提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以小麥品種華麥8號為材料，溫室培養，室溫18 ℃。小麥開花當天掛牌標記開花麥穗，用記號筆點穎的方法標記穗中部開花小穗。在開花后不同時間段選取標記小穗第一、第二粒位穎果作為試驗材料。另外取適量種子，蒸餾水清洗后以1%～3% H2O2處理5 min。蒸餾水清洗2～3遍后水中浸泡3 h。將吸足水分的種子在鋪有濕潤濾紙的培養皿中進行培養，3～5 d后取根尖包括根冠在內約7 mm的區段進行石蠟包埋。

1.2 方法

將取得的根尖以及穎果材料用含有甘油的FAA固定8 h左右，石蠟包埋、切片，切片厚度7～10 μm。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗后用PBS浸泡5 min。3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，3 min×3次。5%～10%正常羊血清進行封閉，室溫下孵育10 min。孵育后傾去血清，勿沖洗，滴加適當比例（1∶100）稀釋后的一抗（Santa Cruz），4 ℃下過夜。PBS沖洗，3 min×3次。滴加適當比例（1∶100）稀釋過的生物素標記的二抗（1% BSA-PBS稀釋），37 ℃下孵育10～30 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加適當比例（1∶100）稀釋過的辣根酶標記的鏈霉卵白素（1% BSA-PBS稀釋），37 ℃下孵育10～30 min。PBS沖洗，3 min×3次。之后DAB（北京中杉金橋生物技術公司生產的DAB顯色試劑盒）顯色。最后用自來水充分沖洗，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以血清孵育后不滴加一抗為對照。

2 結果與分析

2.1 Cathepsin B-like蛋白在穎果中的分布與變化

2.1.1 Cathepsin B-like蛋白在糊粉層與內果皮中的分布與變化 在開花后1 d的小麥穎果中（圖1A），內果皮細胞開始在灌漿池外緣出現；該時期的內果皮細胞尚未出現伸長現象，胞內有強烈的Cathepsin B-like蛋白免疫陽性反應，同時期的果皮細胞只有零星陽性反應；糊粉層在該時期尚未形成。在開花后3 d的穎果中（圖1B），內果皮細胞仍然未出現伸長，胞內有強烈的Cathepsin B-like蛋白免疫陽性反應；此時的果皮中只有零星細胞的細胞核還保持完整，核內有一定強度的陽性信號；糊粉層開始形成，但形態特征不明顯。開花后9 d的穎果中（圖1C），內果皮細胞開始伸長，胞內出現強烈的Cathepsin B-like蛋白陽性信號；此時果皮細胞的情況與開花后3 d時類似；糊粉層形成，細胞形狀規則，細胞核中有一定強度的Cathepsin B-like蛋白陽性信號，該信號的強度和含量都低于內果皮細胞。在開花后12 d的穎果中（圖1D），內果皮細胞繼續伸長，胞內Cathepsin B-like蛋白陽性信號強烈，分布均勻；果皮細胞中的細胞核已基本解體，細胞質皺縮，只有少量陽性信號反應；糊粉層中的Cathepsin B-like蛋白陽性信號開始增強，其在糊粉層細胞中的分布已不局限于細胞核，而是均勻分布在整個細胞中，信號強度低于內果皮細胞。開花后14 d的穎果中（圖1E），內果皮細胞的形狀開始變得不規則，胞內Cathepsin B-like蛋白陽性信號強烈，分布不均勻，開始向細胞邊緣收縮聚集；果皮細胞的胞內物質已基本解體，觀察不到陽性信號；糊粉層細胞內Cathepsin B-like蛋白陽性信號的強度和分布與開花后12 d時類似。開花后16 d的穎果中（圖1F），內果皮、果皮細胞中的陽性信號強度和分布與開花后14 d時類似，糊粉層中的陽性信號強度繼續增強。開花后18 d的穎果中（圖1G），內果皮細胞的陽性信號只分布在細胞的邊緣區域，糊粉層細胞陽性信號強度繼續增強，強度與內果皮細胞中的信號一致。開花后24 d的穎果中（圖1H），內果皮細胞的陽性信號主要分布在細胞的邊緣區域，強度和含量均有所下降，糊粉層細胞陽性信號強度超過內果皮細胞。圖1I為不加一抗的對照。

2.1.2 Cathepsin B-like蛋白在穎果維管束中的分布與變化 在開花后1 d小麥穎果的兩側維管束中（圖2A），薄壁細胞的細胞質和細胞核中均有Cathepsin B-like蛋白的免疫陽性信號，其中細胞核內的陽性信號強于細胞質；在開花后6 d的穎果兩側維管束中（圖2B），薄壁細胞胞質中的陽性信號已觀察不到，只有核中還有較為強烈的陽性信號；在開花后9 d的穎果兩側維管束中（圖2C），薄壁細胞的細胞質和細胞核中均已沒有陽性信號。在之后的發育過程中則觀察不到明顯的穎果兩側維管束。

在開花后1 d的穎果背部維管束中（圖2D），陽性信號較弱，且沒有明顯的特異性；在開花后14 d的穎果背部維管束中（圖2E），合點細胞和木質部薄壁細胞中出現了強于周邊細胞的Cathepsin B-like蛋白陽性信號；在開花后24 d（圖2F）的穎果背部維管束中，合點細胞內的陽性信號開始消失，而木質部薄壁細胞中依舊保留有一定的Cathepsin B-like蛋白陽性信號。

2.2 Cathepsin B-like蛋白在根部原生韌皮部篩分子中的分布與變化

在距根尖頂端343 μm處的根部組織中（圖3A），原生韌皮部篩分子與其伴胞內均有強烈的Cathepsin B-like蛋白陽性信號，該信號在篩分子與伴胞中的分布相對均勻，強度與周圍細胞一致；在距根尖頂端427 μm處的組織中（圖3B），原生韌皮部篩分子內陽性信號的分布開始收縮，強度與伴胞和周圍細胞中的信號強度一致；在距根尖頂端462 μm處的組織中（圖3C），原生韌皮部篩分子內的陽性信號分布變化不大，但強度開始衰弱；在距根尖頂端525 μm處的組織中（圖3D），原生韌皮部篩分子內只能觀察到微弱的陽性信號；在距根尖頂端602 μm處的組織中（圖3E），原生韌皮部篩分子內已觀察不到任何陽性信號反應，伴胞內的陽性信號仍然比較強烈，與周圍細胞的信號強度一致；在距根尖頂端889 μm處的根部組織中（圖3F），原生韌皮部周圍薄壁細胞的陽性信號開始消失，伴胞內可以觀察到較強的陽性信號。

3 小結與討論

本試驗研究結果顯示，在小麥穎果內果皮、糊粉層、穎果兩側維管束、穎果合點細胞、穎果背部木質部導管以及根部原生韌皮部篩分子的發育過程中都有Cathepsin B-like蛋白的參與。這些部位的細胞均已被證實發生了細胞程序性死亡過程（Programmed cell death，PCD）。Vercher等[6]在豌豆中觀察到內果皮細胞在發育過程中有伸長現象，在伸長過程中，細胞質密度下降，液泡增大，并發生了一系列退化事件，包括質體丟失、高爾基體退化等現象，最終胞內內含物消失，細胞死亡，形成厚壁組織。糊粉層由胚乳的表層細胞發育轉化而來，在子粒的萌發過程中，胚會釋放出赤霉素，誘導糊粉層產生蛋白酶、淀粉酶等水解酶類，分解胚乳中蛋白質和淀粉等物質[7]，為胚的生長提供養分，之后糊粉層則發生程序性細胞死亡[8，9]。筆者前期研究發現，小麥韌皮部篩分子發育過程中細胞器發生有序解體，同時檢測到呈TUNEL陽性反應的細胞核，還有細胞核降解等一系列細胞學事件[10]，與經典的植物細胞PCD特征類似[11]，說明篩分子發育是一種PCD過程；木質部導管的形成也已被證明屬于典型的PCD過程[12，13]。Kladnik等[14]通過DAPI、TUNEL檢測以及電子顯微鏡觀察證實，玉米合點細胞的發育過程中出現了DNA片段化、質膜解體等PCD特征，并推測該過程可能與木質部導管的PCD過程類似。

本試驗結果顯示，在上述組織細胞發生PCD之前，其細胞內的Cathepsin B-like蛋白陽性信號在分布和強度上都會達到一個高峰期，該時期的Cathepsin B-like蛋白陽性信號在細胞內均勻分布，信號反應強烈。隨著PCD進程的開始，陽性信號在細胞內的分布減少，信號強度逐漸減弱直至消失，推測Cathepsin B-like蛋白含量和活性的變化對PCD進程的推進產生了影響。糊粉層的PCD進程在種子萌發期開始，將在以后進一步研究。

在由無血清培養引起的PC12細胞的凋亡過程中，過表達Cathepsin B的細胞增強了生存活力；而CA074（Cathepsin B的特異性抑制劑）或者Cathepsin B的反義寡核苷酸片段可以引起細胞的主動死亡。這些結果表明細胞中可能存在一條由Cathepsins調節的細胞死亡途徑，而Cathepsin B則抑制了該死亡，增強了細胞活性[2]。

張文虎[15]認為糊粉層中貯存著大量的脂類物質，細胞壁較厚，細胞之間緊密排列并具有生命活性，可以對微小的環境變化做出相應反應，從而維持胚乳營養成分長期不變。糊粉層的這種作用要求糊粉層細胞在種子萌發之前的相當長時間內都保持細胞活性。筆者在糊粉層的發育過程中觀察到了Cathepsin B-like蛋白的增加和積累，從這一個方面也證實了Cathepsin B-like蛋白抑制細胞的程序性死亡，維持細胞活性的推論。結合以上結果和分析，推測Cathepsin B-like蛋白具有維持細胞活性、推遲PCD進程的作用。隨著其在細胞中含量和活性的減少，植物發育所需的PCD進程才得以推進。

參考文獻：

[1] BARRETT A J， KIRSCHKE H. Cathepsin B， cathepsin H，cathepsin L[J].Methods Enzymol，1981，80：535-561.

[2] UCHIYAMA Y. Autophagic cell death and its execution by lysosomal cathepsins[J]. Arch Histol Cytol，2001，64（3）：233-246.

[3] LEIST M， J？魧？魧TTEL？魧 M. Triggering of apoptosis by cathepsins[J].Cell Death and Differentiation，2001，8（4）：324-326.

[4] JOHNSON D E.Noncaspase proteases in apoptosis[J].Leukemia，2000，14（9）：1695-1703.

[5] CEJUDO F J， MURPHY G， CHINOY C， et al. A gibberellin-regulated gene from wheat with sequence homology to cathepsin B of mammalian cells[J]. The Plant Journal，1992， 2（6）：937-948.

[6] VERCHER Y， MOLOWNY A，CARBONELL J. Gibberellic acid effects on the ultrastructure of endocarp cells of unpollinated ovaries of Pisum sativum[J]. Physiologia Plantarum，2006，71（3）：302-308.

[7] DAUDDANT J， SUSUMU M， MITSUI T， et al. Enzymic mechanism of starch breakdown in germinating rice seeds[J].Plant Physiol，1983，71：88-95.

[8] YOUNG T E， GALLIE D R. Programmed cell death during endosperm development[J]. Plant Mol Biol， 2000，44：283-301.

[9] JOHNSON K L， DEGNAN K A， WALKER R J， et al. AtDEK1 is essential for specification of embryonic epidermal cell fate[J] Plant J，2005，44（1）：114-127.

[10] WANG L， ZHOU Z， SONG X， et al. Evidence of ceased programmed cell death in metaphloem sieve elements in the developing caryopsis of Triticum aestivum L.[J]. Protoplasma，2008，234（1-4）：87-96.

[11] PENNELL R I，LAMB C. Programmed cell death in plants[J]. The Plant Cell，1997，9：1157-1168.

[12] 毛同林，吳曉東，楊世杰.洋蔥根冠外緣細胞編程性死亡過程中的超微結構研究[J].電子顯微學報，2001，20（1）：17-20.

[13] EARNSHAW W C. Nuclear changes in apoptosis[J].Curr Opin Cell Biol，1995，7（3）：337-343.

[14] KLADNIK A， CHAMUSCO K， DERMASTIA M， et al. Evidence of programmed cell death in post-phloem transport cells of the maternal pedicel tissue in developing caryopsis of maize[J].Plant Physiology，2004，136（3）：3572-3581.

[15] 張文虎.關于稻麥糊粉層發育的研究[D].江蘇揚州：揚州大學，2008.