土壤中產天然維生素E真菌新資源的篩選

摘要：采用稀釋平板分離法獲得67株真菌，測定其維生素E（VE）含量，以期從土壤中篩選出富含天然VE的真菌新資源。采用高效液相色譜法進行VE含量檢測，其中有10株真菌能產生天然VE；通過形態與分子系統學手段對10株菌株進行鑒定，有5株菌株鑒定到種，分別屬于馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）、爪哇棒束孢（Isaria javanica）和淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum），2株菌株鑒定到屬，均為戴氏霉屬（Taifanglania）；另外3株菌株序列未測出。對其中兩株VE含量較高的菌株——馬昆德擬青霉和爪哇棒束孢從碳源和氮源方面進行了初步的培養基優化，結果表明不同的碳源、氮源對VE含量均有一定影響。

關鍵詞：真菌；新資源；篩選；天然維生素E；土壤

中圖分類號：S182；Q939.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4066-03

Screening of New Resources of Natural Vitamin E Producing Fungi from Soil

ZHANG Yan-wei1，HAN Yan-feng2，LIU Xun1，LIANG Zong-qi2

（1.School of Chemistry and Life Sciences， Guizhou Normal College， Guiyang 550018，China；

2.Institute of Fungus Resources，College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Abstract： 67 fungal strains were obtained by dilution plate； and their natural vitamin E content was determined by fluorescence spectrophotometry and HPLC to screen new resources of natural vitamin E producing fungi. 10 strains were identified as vitamin E producing fungi. According to morphology and molecular systematics， 5 strains were identified as Paecilomyces marquandii， Isaria javanica， Purpureocillium lilacinum； 2 strains belonged to Taifanglania genus； and 3 strains was not able to be sequenced. The carbon and nitrogen sources of medium for two high vitamin E producing strains， P. marquandii and I. javanica， was optimized； and results showed that different nitrogen and carbon sources affected their vitamin E content to a certain degree.

Key words： fungi； new resources； screen； natural vitamin E； soil

收稿日期：2013-04-18

基金項目：貴州省教育廳自然科學基金項目（2008059）

作者簡介：張延威（1979-），男，山西山陰人，副教授，在讀博士研究生，研究方向為真菌資源與應用，（電話）0851-5816647（電子信箱）

zyw_email@163.com。

維生素E（Vitamin E，VE）又稱生育酚， 通常為淡黃色油狀，為脂溶性物質；在無氧或氧化劑存在時對熱、酸、堿一般穩定，反之則氧化成醌類；對可見光穩定，但可被紫外光破壞。VE是生育酚（Tocopherol）、生育三烯酚（Tocotrienol）及其能夠或多或少地顯示D-α-生育酚生物活性的一類衍生物的總稱，常見的有4種，即α、β、γ和δ-生育酚，其生理作用類似，其中以α-生育酚生理活性最高[1，2]。它在人體內不能自行合成，必須從外界攝取。VE是一種很強的抗氧化劑，在體內可阻止自由基反應的進行，延緩機體衰老，維持生育功能，調節機體的免疫系統，能將某些惡性腫瘤細胞逆轉為正常表現形的細胞，還具有維持結締組織彈性、促進血液循環等功能[3-8]。

VE有兩種來源，即天然VE和合成VE。天然VE在結構上純度較高，生理活性較強，生物利用度較好，更易于被人體吸收，且具有更高的安全性。因此，一般在涉及醫藥、食品添加劑、營養劑、保健品、化妝品等方面更傾向于使用天然VE；合成VE則主要應用于飼料添加劑等方面[9-11]。由于天然VE的特點及人們對天然綠色產品的青睞，天然VE的市場需求逐年增長，尤其在藥品類和保健品類天然VE越來越受到關注[12]。

天然VE廣泛分布于動植物組織中，主要來源是植物油及油脂加工產物脫臭餾出物中[13-15]。目前工業生產上，國內外主要以植物油精煉加工時所得脫臭餾出物和殘渣（渣油）為原料來提取[16，17]，由于生產原料來源有限，尤其是國內其生產受到了制約[18]。如要更廣泛地開發利用天然VE，新的天然VE來源顯得尤為重要。真菌易培養、生長周期短，可在短時間內大量生產且不破壞自然資源，在生產應用上有明顯優勢。關于產天然VE真菌有文獻報道的很少，主要是幾種蟲生擬青霉類真菌[19，20]，土壤真菌也有，但含量很低[21]。土壤是真菌類群非常豐富的基質，故本研究擬從土壤中篩選高產VE的真菌新資源，為天然VE的開發利用提供一條新來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株是從不同地區采集的土壤中分離純化得到的真菌菌株，共67株，編號為MF1-MF67。

1.1.2 儀器與試劑 所用儀器有Agilent1100高效液相色譜儀、Agilent熒光分光光度計。所用試劑有甲醇、石油醚、抗壞血酸、KOH，均為國產分析純，VE標準品購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 待測菌株的培養 ①測定VE菌株的培養。將待測菌株接種于PDA液體培養基中搖瓶培養15 d，取出菌絲，用濾紙吸干水分，待測。②測序菌株的培養。將待測菌株接種于PDA固體培養基恒溫培養10 d，收集菌絲，待測。

1.2.2 VE的測定方法

1）高效液相色譜儀測定。精確稱取新鮮菌絲樣品0.5 g，烘干后用研缽粉碎，加入無水甲醇5 mL超聲30 min，0.45 μm濾膜微濾后進樣檢測，檢測結果為樣品重復檢測3次的均值。

色譜檢測條件：Hypersil ODS2色譜柱 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水=98∶2；流速1.0 mL/min；檢測器為紫外檢測儀，波長292 nm；柱溫30 ℃；進樣閥體積20 μL。

2）熒光分光光度計測定。精確稱取新鮮菌絲樣品1.0 g，加入5%（質量分數）的抗壞血酸水溶液5 mL，10 mol/L的KOH溶液5 mL，在水浴中加熱并振搖，溫度控制在70～80 ℃皂化15 min后移出冷卻，加去離子水定容到25 mL，用石油醚40 mL分3次萃取，合并萃取液，用去離子水洗滌萃取液至中性，于旋轉蒸發儀中蒸干，用甲醇溶解剩下固體并定容至10 mL，過0.45 μm濾膜微濾后上樣檢測。同時稱取等量菌絲樣品，烘干后再次稱量，計算樣品水分率。將檢測結果折算為菌絲干重含量， 結果為樣品重復檢測3次的均值。

熒光檢測條件：激發波長為295 nm，檢測波長為330 nm，空白對照為甲醇。

1.2.3 菌株rDNA序列的測定與分析 將收集好的待測菌絲用DNA提取試劑盒提取其總DNA，用ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3′）引物進行PCR擴增，擴增產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

將菌株序列與從GenBank上blast后下載的相關序列用CLUSTAL 1.83進行序列比對，然后用MEGA 5.05中的最大簡約法（MP），經1 000次Bootstrap驗證，構建系統發育樹。

1.2.4 培養基成分對菌株VE含量的影響 以PDA培養基為基本培養基（CK），分別添加不同的碳源、氮源，比較添加了不同成分的培養基對菌株產VE量的影響。添加的碳源、氮源見表1。

2 結果與分析

2.1 菌株VE檢測結果

對獲得的67株真菌菌株搖瓶培養后收集菌絲，經高效液相色譜法檢測，其中有10株菌株含有VE（表2）。

2.2 產VE真菌菌株的鑒定

對以上10株菌株用察氏培養基培養，進行形態學鑒定。同時通過MEGA 5.05軟件MP法構建的系統發育樹進行驗證，結果見圖1。其中5株菌株已鑒定到種，即MF31為馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）；MF32在系統樹中與爪哇棒束孢（Isaria javanica）和玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）聚為一類，不能區分，結合其形態特征中的孢子特征，確定為爪哇棒束孢；MF33、MF34和MF40 均為淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。菌株MF24、MF30和MF65序列未測出，根據菌株形態特征不能確定其歸屬。菌株MF25和 MF27從形態特征和系統樹聚類結果表明屬于戴氏霉屬（Taifanglania），具體屬何種戴氏霉有待進一步鑒定。

2.3 培養基成分對菌株VE含量的影響

選取VE含量高且在搖瓶培養中菌絲量大、生長快的菌株進行試驗。根據表2檢測結果及菌株在搖瓶培養中菌絲生長情況，選取MF31和MF32兩株菌株按照表1添加不同的碳源和氮源，分組搖瓶培養，用熒光分光光度計檢測其菌絲干重VE含量，結果如表3所示。培養基中加尿素后兩菌株均不能生長，故表中無尿素數據。由表3可以看出，PDA培養基（CK）培養后，MF32的干菌絲VE含量明顯高于MF31，當培養基中添加不同碳源、氮源后對兩菌株菌絲的VE含量有明顯影響。對于MF31，添加兩種碳源后其菌絲VE含量降低，尤其是添加甘露糖后，其VE含量僅為對照的1/5；而添加兩種氮源后，其菌絲VE含量明顯升高。對于MF32，兩種碳源對其菌絲VE含量影響不是很明顯，而添加兩種氮源后，其菌絲VE含量明顯下降。

3 討論

從67株真菌菌株中檢測出有10株菌株產VE，檢出率為14.93%，可見在土壤中產VE的真菌數量并不少，從土壤中尋找新的天然VE資源是可行的。在培養基成分試驗中，VE含量最高可達1 167.88 μg/g（DW）。而該試驗僅是從碳源和氮源方面做了初步的探究，相信通過進一步優化培養條件或采用誘變等其他技術手段，其VE含量還有提高的可能，可見從土壤中篩選出具有生產應用價值菌株的可能性是有的。

在培養基成分對菌株VE含量的影響的試驗中，VE檢測采用的是熒光分光光度計測定法。其原理是VE中的α-生育酚的分子結構中具有苯環，因此具有熒光，且其熒光強度與樣品中VE含量呈正比[22]。由于VE是一類衍生物的總稱，每種同系物的激發波長和發射波長的熒光強度不相同，用固定的激發波長和發射波長所測定的值與VE總含量的真實值之間是有誤差的。在本試驗中測出的VE含量實際上是α-生育酚的含量，加之樣品經過皂化VE含量會有損失，故其VE總含量應該更高。

綜上所述，可知從土壤中尋找新的天然VE資源是一條值得考慮的途徑。

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