桂林市公園蘇云金芽孢桿菌菌株的分離

摘要：從桂林市部分公園采集了80份土樣，分離得到11株蘇云金芽孢桿菌，并對其殺蟲晶體蛋白的形態及表達情況進行了研究。通過光學顯微鏡觀察，發現這些菌株產生的伴孢晶體有菱形、球形、不規則形等。利用SDS-PAGE對蛋白進行分析，結果表明9株蘇云金芽孢桿菌表達的蛋白大小約為135 ku，5株表達蛋白大小約65 ku，1株表達蛋白大小約90 ku，1株表達蛋白大小約45 ku，5株同時表達約135 ku和65 ku兩種蛋白。產小菱形晶體的菌株7-4可能對美國白蛾有高毒力，值得進一步深入研究。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；伴孢晶體；光學顯微觀察；SDS-PAGE

中圖分類號：S476.11 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4107-03

Isolation of Bacillus thuringiensis from parks in Guilin

ZHU Gui-mei，LIU Jian-guo，LONG Shi-hua，HAO Zai-bin

（College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541006， Guangxi，China）

Abstract： 11 Bacillus thuringiensis（Bt） isolates were obtained from 80 soil samples collected from some parks in Guilin，and the morphology and expression of insecticidal crystal proteins from these strains were futher studied. The optical microscopic observation showed that there were bipyramidal， spherical， and irregular parasporal crystals in the 11 Bt isolates. Analysis of proteins by SDS-PAGE indicated that 9 Bt isolates could express proteins with 135 ku molecular mass， 5 strains with 65 ku， 1 strain with 90 ku， 1 strain with 45 ku， and 2 isolates expressed both 130 ku and 60 ku proteins. Strain 7-4 producing small bipyramidal crystal protein may have high toxcity to Hyphantria cunea（Drury）， which deserved to be further studied.

Key words： Bacillus thuringiensis； parasporal crystal； optical microscopic observation； SDS-PAGE

收稿日期：2013-01-21

基金項目：國家高技術研究發展計劃項目（2008ZX08001-001）； 國家重點基礎研究發展計劃項目（2009CB118902）；國家自然科學基金項目

（31060193）

作者簡介：朱桂梅（1988-），女，廣西桂林人，在讀碩士研究生，主要研究方向為生物活性物質開發與利用，（電話）15878345027（電子信箱）

e_zhuguimei@126.com；通訊作者，郝再彬（1958-），男，教授，博士生導師，主要從事生物活性物質開發與利用研究，

（電子信箱）haozaibin2010@126.com。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種在自然界中廣泛分布的革蘭氏陽性芽孢桿菌，是目前世界上用途最廣、應用最成功、產量最大的微生物殺蟲劑[1]，可作為化學農藥的替代品[2，3]，已成為生物農藥研究的重點和熱點。Bt在芽孢形成過程中，能在菌體的一端或兩端產生一個或多個形狀一致或不同的伴孢晶體（Parasporal crystal）[1，2]，又稱殺蟲晶體蛋白（Inseticidal crystal proteins，ICPs）或δ-內毒素（Delta-endotoxin）[4，5]，由cry或cyt基因編碼，是Bt殺蟲活性的主要來源[6]。研究表明，ICPs具有高效、廣譜的殺蟲作用，對人畜及非目標昆蟲無害，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目以及吸蟲、鞭毛蟲、線蟲、螨類和原生動物等200多種害蟲具有毒力作用[5，7-9]，且具有抗癌作用[10]。

由于Bt殺蟲晶體蛋白和殺蟲基因的巨大應用價值，許多國家如西班牙[11]、巴西[3]、土耳其[12]、韓國[13]、突尼斯[14]等將Bt新資源的收集與開發作為重點，開展大規模資源采集、分析的基礎性工作，期望找到高效廣譜的Bt菌，發現新的cry基因，并通過各種現代生物技術手段如基因重組、原生質體融合等構建高效廣譜殺蟲工程菌、培育抗蟲轉基因植物。廣西桂林地形屬于喀斯特地貌，關于桂林地區的Bt研究始于2009年[15]，但迄今相關研究甚少。本研究從桂林部分公園采集的80份土樣中分離Bt菌株，分別利用光學顯微鏡觀察和SDS-PAGE對Bt菌株產生的伴孢晶體的形態和表達進行了分析，為豐富桂林地區的Bt資源及以后的基因型鑒定、生物活性預測、篩選出新的高效生產菌株、克隆新型cry基因等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Bt標準菌株HD-1：由中國農業科學院植物保護研究所提供。本研究以HD-1作為對照菌株。

1/2 LB固體培養基：蛋白胨0.5%，酵母提取物0.25%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%，調pH至7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

堿性復紅染色液：準確稱取堿性品紅1.00 g，置于研缽中，然后量取10 mL無水乙醇于研缽中緩慢研磨，至品紅溶解，再量取5 mL飽和酚溶液至研缽中，繼續研磨，使品紅充分溶解，最后加去離子水定容至100 mL，4 ℃冰箱避光保存備用。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集 從廣西桂林西山公園、疊彩山公園等公園采集土樣。設置采樣點，從采樣基點開始每隔100 m一個樣品。采樣時虛擬一個正方形，每隔約2 m，共于8個點處去除表層土壤，取距表層5～10 cm處的土壤30 g混合，裝在一個無菌自封袋中作為一個樣品，標注采樣點、采樣日期、編號、采樣人等信息。

1.2.2 Bt菌株分離與保存 采用溫度篩選法分離Bt菌株。取16.0 g土樣放入裝有160 mL去離子水和玻璃珠的塑料瓶中，旋渦混合器振蕩3～5 min，將土粒打碎，然后80 ℃水浴20 min，將非芽孢菌充分殺死；待靜置3 min后，稀釋菌懸液，選取10-2、10-3兩個稀釋度，分別吸取l00 μL菌懸液于1/2 LB固體培養基上，涂布均勻，每個梯度設兩個平行，30℃恒溫培養72 h。挑選疑似Bt的菌落涂片，堿性復紅染液染色3～5 min，在16×100倍油鏡下觀察菌株伴孢晶體的有無及形態。將凡能形成伴孢晶體的菌株作為Bt菌株，劃線純化，-20 ℃ 10%甘油保存備用。

1.2.3 SDS-PAGE 分析刮取2 mg培養48 h的Bt菌體于1.5 mL離心管中，用1 mL無菌水懸浮，12 000 r/min離心1 min，棄上清；用400 μL 1 mol/L NaCl重懸，12 000 r/min離心2 min，棄上清；用400 μL去離子水重懸，12 000 r/min離心2 min，棄上清，如此重復3次，離心棄上清；用50 μL去離子水懸浮，加入40 μL新配0.5 mmol/L NaOH室溫作用5 min；加入65 μL 3×上樣緩沖液，混勻后，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min。取10 μL上清液，進行10% SDS-PAGE分析[13]。

2 結果與分析

2.1 Bt菌株分離

本研究從桂林部分公園采集土樣80份，結合溫度篩選法和光學顯微觀察，分離出11株野生Bt菌株（表1），出土率為13.75%。出土率相對較低，是因為廣西桂林喀斯特地貌土壤中巖石成分比較多，含高濃度的礦物質，土壤比較貧瘠，生物多樣性較低[15]。

2.2 伴孢晶體形態

以Bt標準菌株HD-1為對照菌株，通過光學顯微鏡觀察，發現11株野生Bt菌株產生的伴孢晶體形狀有大、小菱形，大、小球形及不規則形等（表1，圖1）。伴孢晶體形態豐富，表明桂林地區可能蘊藏著豐富的未知Bt資源。其中，2株產生菱形晶體，4株產生球形晶體，5株產生兩種或兩種以上形狀的晶體。而菱形與球形共存于同一菌體，這可能是由于菱形晶體蛋白被蛋白酶降解，晶體蛋白棱角被鈍化和切片位置不同造成的。

2.3 SDS-PAGE分析

以Bt標準菌株HD-1為對照，按照1.2.3的方法對11株野生Bt分離菌株進行殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE分析。結果如表1所示，11株分離株的蛋白圖譜如圖 2所示。結果表明，9株表達蛋白分子質量約135 ku，5株表達蛋白分子質量約65 ku，1株表達蛋白分子質量約90 ku，1株表達蛋白分子質量約45 ku，5株同時表達分子質量約65、135 ku兩種蛋白。而產菱形晶體蛋白的分離株除21-9外都表達分子質量約135 ku蛋白，可能21-9含有與其他8株不同的基因型。趙煥麗等[16]和董明等[17]研究發現產小菱形晶體蛋白的Bt菌株對美國白蛾有較高毒力。在本研究中，產生小菱形晶體蛋白的菌株7-4與HD-1有相同的蛋白表達譜，預測其可能含cry基因并對美國白蛾有較高毒力，有待進一步研究。此外，對11株Bt分離株進行SDS-PAGE分析并未檢測到對癌細胞有殺傷力的約81 ku蛋白，與以往的報道相符合，主要是由于該基因通常是沉默的，在Bt菌株中不表達[15]。

3 結論

從桂林部分公園土壤中分離得到11株Bt分離株，豐富了桂林地區的Bt資源。通過SDS-PAGE分析，菌株21-9可能含有與其他產菱形晶體的分離株不同的基因型；產小菱形晶體的菌株7-4與標準菌株HD-1有相同的蛋白譜，有可能對美國白蛾有高毒力，有待進一步研究。

參考文獻：

[1] BRAVO A， LIKITVIVATANAVONG S， GILL S S， et al. Bacillus thuringiensis： A story of a successful bioinsecticide[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2011，41（7）：423-431.

[2] SHARMA A， KUMAR S， BHATNAGAR R K. Bacillus thuringiensis protein Cry6B （BGSC ID 4D8） is toxic to larvae of Hypera postica[J]. Current Microbiology，2011，62（2）：597-605.

[3] VALICENTE F H， DE TOLEDO PICOLI E A， DE VASCONCELOS M J V， et al. Molecular characterization and distribution of Bacillus thuringiensis cry1 genes from Brazilian strains effective against the fall armyworm， Spodoptera frugiperda[J]. Biological Control，2010，53（3）：360-366.

[4] GOUGH J M， KEMP D H， AKHURST R J， et al. Identification and characterization of proteins from Bacillus thuringiensis with high toxic activity against the sheep blowfly， Lucilia cuprina[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2005，90（1）：39-46.

[5] SU X D， SHU C L， ZHANG J， et al. Identification and distribution of Bacillus thuringiensis isolates from primeval forests in Yunnan and Hainan Provinces and Northeast Region of China[J]. Agricultural Sciences in China，2007，6（11）：1343-1351.

[6] 孫曉東，李朝緒，呂朝軍，等.海南濱海椰林Bt菌株的篩選與鑒定[J].熱帶作物學報，2012，32（11）：2129-2132.

[7] 白 成，劉麗平，鄢小寧，等.蘇云金芽孢桿菌的概況及其研究進展[J].熱帶農業科學，2012，32（8）：33-38.

[8] 李 雪，馬玉超，李 煦，等.蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的研究進展[J].安徽農業科學，2012，40（10）：5920-5924.

[9] YLMAZ S， AYVAZ A， AKBULUT M， et al. A novel Bacillus thuringiensis strain and its pathogenicity against three important pest insects[J]. Journal of Stored Products Research，2012， 51：33-40.

[10] MIZUKI E， OHBA M， AKAO T， et al. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusions： in vitro cell-killing action on human cancer cells[J]. Journal of Applied Microbiology，2001，86（3）：477-486.

[11] QUESADA M E， GARCIA T E， VALVERDE G P， et al. Isolation， geographical diversity and insecticidal activity of Bacillus thuringiensis from soils in Spain[J]. Microbiological Research，2004，159（1）：59-71.

[12] APAYDIN ？魻， ？覶NAR ？覶， TURANLI F， et al. Identification and bioactivity of native strains of Bacillus thuringiensis from grain-related habitats in Turkey[J]. Biological Control，2008， 45（1）：21-28.

[13] LEE D W， JE Y H， KOH Y H. Bacillus thuringiensis isolates from Korean forest environments[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology，2012，15（2）：237-239.

[14] SAADAOUI I， ROUIS S， JAOUA S. A new Tunisian strain of Bacillus thuringiensis kurstaki having high insecticidal activity and delta-endotoxin yield[J]. Archives of Microbiology， 2009，191（4）：341-348.

[15] 孫曉東，張靜濤，束長龍，等.桂林喀斯特地貌分布區蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定[J].中國生物防治，2009（2）：138-142.

[16] 趙煥麗，陸秀君，靳愛榮，等.對美國白蛾高毒力蘇云金桿菌菌株的篩選[J].河北農業大學學報，2009，32（2）：89-92.

[17] 董 明，杜立新，王容燕，等.一株對美國白蛾高毒力蘇云金芽孢桿菌的殺蟲基因鑒定[J].中國農學通報，2010，26（3）：242-244.

（責任編輯 張 毅）