防御酶與不同地理種源馬尾松松材線蟲病抗性的關系

摘要：采用比色法及聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）測定了一年生馬尾松（Pinus massoniana）抗性種源衡陽1號和敏感種源廣西1號接蟲松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）后其過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性及其同工酶的動態變化。結果表明，在抗性種源中，POD活性有2個峰值，PPO活性有1個峰值，且兩種酶活性的峰值明顯高于敏感種源。同工酶活性電泳圖譜顯示，盡管在兩種種源的POD、PPO同工酶譜中均未見有新的酶帶產生，但抗性種源中活性增強的POD同工酶酶帶數量要多于敏感種源，且一些PPO同工酶酶帶也能對松材線蟲侵染作出較快反應。因此，POD和PPO在馬尾松抗松材線蟲病中發揮重要作用。

關鍵詞：松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）病；防御酶；馬尾松（Pinus massoniana）；種源；抗性

中圖分類號：S791.248，S763.49 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4119-04

Relationship between Defense Enzyme and Masson Pine with Different Provenance Resistance to Pine Wood Nematode Disease

TENG Tao，WANG Fang-yu，HE Li-fang，LIU Jian-hui，LI Yu-zhong

（Department of Life Science， Hengyang Normal University， Hengyang 421008，Hunan，China）

Abstract： Colorimetry and polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE） was used to comparatively study the dynamic change of activity of peroxidase（POD） and polyphemol oxidase（PPO） and their isoenzymes in masson pine（Pinus massoniana） resistant provenance Hengyang No. 1 and sensitive provenance Guangxi No. 1 after inoculation of pine wood nematode（Bursaphelenchus xylophilus）. The results showed that activity of POD and PPO had two and one peak respectively in the resistant provenance； and the peak value of POD and PPO in resistant provenance was significantly higher than that of sensitive provenance. Isoenzyme electrophoresis revealed that though no new isozyme band of POD and PPO was detected in the resistant and sensitive provenance， the bands of enhanced POD isozyme of the resistant provenance were more than that of the sensitive provenance； meanwhile， some of PPO isozyme bands responded quickly to the invasion of pine wood nematode. These results suggested that POD and PPO played important roles in masson pine’s resistance against pine wood nematode.

Key words： pine wood nematode（Bursaphelenchus xylophilus） disease； defense enzyme； masson pine（Pinus massoniana）； provenance； resistance

收稿日期：2013-05-10

基金項目：湖南省教育廳項目（09C170）；衡陽師范學院教改項目（JYKT201225）

作者簡介：滕 濤（1982-），男，湖南衡陽人，講師，碩士，主要從事植物抗病生理生化研究，（電話）15873488053（電子信箱）dreamer0734@163.com。

松材線蟲病是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的發生在松屬樹種上的一種毀滅性森林病害。過去一般認為黑松（Pinus thunbergii）和赤松（Pinus densiflora）是主要的感病樹種，但近年來的研究發現，該病有向馬尾松（Pinus massoniana）蔓延的趨勢，并指出林間感病死亡的松樹中馬尾松所占的比例已增加到50%以上[1]。由于馬尾松是中國南方主要的栽培樹種，因此馬尾松對松材線蟲病的抗性機制研究越來越受到學者的關注。有關這方面的研究已經取得了一些進展，徐福元等[2]、滕濤等[3]認為氨基酸、萜類及酚類物質與馬尾松不同種源的抗病性密切相關。

許多研究已經證明，過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）作為防御酶，在植物受到病原物侵染后的抗病反應中發揮重要作用[4，5]，目前關于馬尾松遭受松材線蟲侵染后的抗病反應是否有相似機制鮮有報道。試驗通過測定接蟲松材線蟲后不同抗性的馬尾松地理種源中POD、PPO活性及其同工酶的動態變化，旨在明確馬尾松松材線蟲病抗性與POD、PPO活性及其同工酶的關系，并為進一步揭示馬尾松抗松材線蟲病的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為由中南林業科技大學篩選出的一年生馬尾松抗性種源衡陽1號及敏感種源廣西1號。

1.2 試驗方法

1.2.1 接蟲與取樣 選取健康且生長基本一致的馬尾松苗，采用人工皮接法[6]向受試馬尾松傷口處注入20 μL（約2 000條）松材線蟲懸浮液，并塞入一棉球，用封口膜封好。每隔3 d取生長一致的當年生馬尾松針葉進行測定，每組設3個重復。對照按上述方法接入等量去離子水。

1.2.2 粗酶液制備 稱取新鮮馬尾松針葉1 g，放入預冷的研缽中，加入預冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液[pH 6.5，內含0.1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）]研磨成勻漿，冷提30 min，4 ℃下3 000 r/min離心，上清液即為酶粗提液。

1.2.3 防御酶活性測定方法 POD酶活性測定反應體系：pH 6.8磷酸鹽緩沖液、愈創木酚、H2O2和酶液。以失活酶液為對照，20 ℃下靜置5 min，在470 nm波長下測光吸收值（優尼科紫外-可見分光光度計2010-PC，下同），以OD470 nm變化0.1為一個酶活單位，用U/g表示酶活性。PPO酶活性測定反應體系：pH 6.8磷酸鹽緩沖液、鄰苯二酚溶液和酶液。以失活酶液作為對照，30 ℃下靜置2 min，420 nm下測定吸光值，以OD420 nm變化0.1為一個酶活力單位，用U/g表示酶活性。

1.2.4 POD、PPO同工酶的電泳及顯色 采用不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE），用5%濃縮膠和7.5%分離膠，電極緩沖液為Gly-Tris緩沖液。每孔點樣15 μL，冰水浴中恒壓電泳，濃縮膠80 V，分離膠100 V，電泳2～3 h，待溴酚藍指示劑遷移至距下延約0.5 cm時停止電泳，做好標記，進行染色。

POD的染色方法：聯苯胺溶液（0.2 g聯苯胺+1.5 mL冰醋酸+8.5 mL去離子水）10 mL，5% EDTA溶液10 mL，4%氯化銨溶液10 mL和0.3% H2O2溶液10 mL，反應5～10 min，顯帶后于去離子水中洗脫剩余的染色液。

PPO的染色方法：稱量鄰苯二酚2.202 2 g和對苯二胺0.1 g，溶于100 mL去離子水中，溶解后過濾即為染色液。顯帶后用1 mmol/L抗壞血酸沖洗5 min，泡在去離子水里過夜，然后在30%的乙醇中保存。

2 結果與分析

2.1 不同地理種源馬尾松接蟲松材線蟲后POD和PPO活性動態變化

2.1.1 POD活性動態變化 由圖1可知，接蟲后3 d，廣西1號（接蟲）和衡陽1號（接蟲）馬尾松POD活性與各自對照相比均有較大幅度提升，且兩個種源馬尾松的POD活性無明顯差異。此后，廣西1號（接蟲）和衡陽1號（接蟲）POD活性開始下降，但廣西1號（接蟲）POD活性下降速度相對較快。12 d時，廣西1號（接蟲）POD活性雖有小幅上升，但隨后活性繼續下降并低于其對照。而衡陽1號（接蟲）的POD活性一直處在較高水平，且于15 d出現第二次高峰，達140.76 U/g，明顯高于同時期的對照及廣西1號（接蟲）。POD活性的動態變化在不同抗性馬尾松中呈現的差異，提示POD活性與馬尾松種源的抗病性有一定關系。

2.1.2 PPO活性動態變化 由圖2可知，接蟲后3 d時兩個種源馬尾松中PPO活性相差不大，9 d時衡陽1號（接蟲）的PPO活性迅速上升至較高水平，并于12 d時達到峰值89.59 U/g。整個測試過程中，衡陽1號（接蟲）PPO活性均高于其對照，而廣西1號接蟲后除3 d和12 d時的PPO活性略高于其對照外，其他各時期酶活性均低于其對照。說明在受到松材線蟲侵染后，馬尾松都有一定的自我調節、抵抗病原物的能力，但衡陽1號調節PPO活性的能力更強，維持時間更長。

2.2 不同地理種源馬尾松接蟲松材線蟲后POD、PPO同工酶的酶譜分析

2.2.1 接蟲后POD同工酶的酶譜分析 接蟲松材線蟲后，衡陽1號和廣西1號馬尾松的POD同工酶酶譜分別見圖3、圖4。結果表明，整個過程中松材線蟲未誘導衡陽1號、廣西1號產生新的酶帶，且兩種源的POD酶帶數均為4條，并可分為A、B兩個區域。衡陽1號的POD同工酶酶譜A區共有3條酶帶，分別為PODⅠ、PODⅡ、PODⅢ，這3條酶帶活性變化趨勢相同，均于15 d時活性升至最高，結合POD活性的測定結果，POD酶活性的升高應與這3條同工酶有關。廣西1號同工酶酶譜A區也有3條酶帶，但僅有PODiii活性發生變化，且無明顯規律，推測應與病害的加劇擾亂了廣西1號POD同工酶基因的正常表達有關。此外，兩不同種源馬尾松的POD同工酶酶譜B區各有1條酶帶，考慮到這兩條酶帶在不同抗性馬尾松中變化特征相似，推測B區這1條酶帶與馬尾松對松材線蟲抗病反應關系不大。

2.2.2 接蟲后PPO同工酶的酶譜分析 接蟲松材線蟲后，衡陽1號和廣西1號馬尾松的PPO同工酶酶譜分別見圖5、圖6。與POD同工酶酶譜測定結果相似，接蟲后的兩種源馬尾松針葉中未見新的酶帶產生，且根據各酶帶遷移率的大小，兩個種源的PPO同工酶酶譜均可分A、B兩個區域。衡陽1號共有4條同工酶帶，其中，B區的酶帶PPOⅣ活性受松材線蟲影響較大。接蟲后12 d，該酶帶不僅活性持續增強，而且表達量也明顯增加。此后，即便是酶帶PPOⅣ活性和表達量皆有所下降，但仍明顯高于接蟲早期水平。此外，酶帶PPOⅠ、PPOⅢ也于15 d時活性達到最高。廣西1號的B區也有1條酶帶，即PPOⅲ，但與衡陽1號B區的PPOⅣ不同，該酶帶在12 d前基本無變化，且在18 d時該酶帶的表達因受到明顯抑制而幾乎消失。

3 小結與討論

POD是植物體內主要的防御酶之一，可將酚氧化成有高毒性的醌類物質，致使植物病原物死亡；也可參與催化木質素的合成，從而增加細胞壁的機械強度，阻止病原物的擴展[7，8]。已有研究表明植物的抗病性與POD的變化有關[9，10]。從本研究可以看出，接蟲3 d后，雖然抗性種源和敏感種源的POD活性均有較大幅度提高，但此后抗性種源的POD活性能在較長時間內維持，并產生兩個活性較高的峰值。而敏感種源POD活性則迅速降低，且明顯低于抗性種源。接蟲后，POD活性動態變化在抗性種源和敏感種源中所表現出的差異，可能與不同地理種源馬尾松的抗病能力有關。該結果與吳樣孫等[11]、羅璇等[12]的研究基本一致。抗性種源和敏感種源馬尾松的POD同工酶酶譜分析結果表明，兩種源A區雖各有3條酶帶，但由于酶帶的顏色和寬度能反映酶活性的強弱和酶含量的多少[13]，因此可知抗性種源活性升高的酶帶數量多于敏感種源，并且結合POD活性動態變化結果可以推測馬尾松種源的抗病性應與衡陽1號POD同工酶酶譜中A區這3條酶帶密切相關。

PPO與POD同屬植物體內重要的防御酶，可催化木質素和酚類物質氧化產物的合成，因此在植物抗病次生代謝中發揮主要作用。一些研究認為，植物在遭受病原侵染后，抗性種源PPO活性明顯高于敏感種源[14，15]；而在另一些研究中則得出相反的結論[16]，本研究的試驗結果支持前一種觀點。可見馬尾松抗性種源在維持細胞抗病代謝活動的能力要強于敏感種源。PPO同工酶酶譜分析結果表明，衡陽1號B區的酶帶PPOⅣ能對松材線蟲侵染迅速做出反應，3～12 d內其活性和表達量都表現為持續增強，且接蟲后期未受到明顯抑制。因此，馬尾松不同地理種源的抗病性可能與PPO同工酶酶譜B區酶帶在變化上的差異有重要關系。此外，衡陽1號PPO同工酶酶譜中A區酶帶PPOⅠ和PPOⅢ在接蟲后15 d內活性也表現為升高，說明這兩條酶帶可能在與PPOⅣ一同抵御松材線蟲侵染中起到輔助作用。

綜上所述，馬尾松對松材線蟲的抗病性差異與防御酶活性及同工酶的變化有關。然而，由于植物的抗病性是建立在一系列的物質代謝基礎上的，是有關抗病性基因通過酶蛋白的表達，有關抗病調控物質的產生來實現的[17]，其過程相當復雜。因此，通過對馬尾松抗病過程中防御酶基因及抗病相關基因的表達調控研究，將更有助于進一步了解馬尾松抗松材線蟲病的機制。

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（責任編輯 童志婷）