絞股藍多糖對小鼠胸腺和脾臟影響的研究

摘要：采用原位末端標記（TUNEL）、過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒（SP）技術，觀察絞股藍多糖對小鼠胸腺、脾臟淋巴細胞凋亡和增殖的影響。結果發現各組胸腺和脾臟中均可見凋亡的淋巴細胞，細胞胞核染色質固縮凝聚，有的形成凋亡小體。統計分析表明，50 mg/kg的絞股藍多糖能促進胸腺和脾臟淋巴細胞的增殖和凋亡，推論可知其可以促進胸腺和脾臟淋巴細胞的更新。

關鍵詞：絞股藍多糖；小鼠胸腺；脾臟；細胞凋亡；細胞增殖

中圖分類號：R967 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4156-05

The influence of Gynostemma Polysaccharide on the Spleen and Thymus of Mouse

ZHOU Shi-qiong1，LU Jun-qiu2，LI Gui-zhi2，ZHOU Yue2，WEI Xiao-rui2，WANG Xiao-li2

（1.Dalu Veterinary Station of Bishan， Bishan 402772，Chongqing，China；

2.College of Animal Science and Technology， Guangxi University，Nanning 530005，China）

Abstract： The influence of gynostemma polysaccharide on lymphocyte apoptosis and proliferation of the spleen and thymus was detected by TUNEL and SP. The results showed the apoptosis cells were found in all groups of spleen and thymus， chromatin of the cell nucleus were pyknosis and cohesion， and some even formed the apoptotic body. The statistical analysis showed that 50 mg/kg gynostemma polysaccharide could promote the lymphocyte proliferation and apoptosis of the spleen and thymus. It indicated that the Gynostemma polysaccharide could provoke the renew of the spleen and the thymus lymph cell on physiological status.

Key words： gynostemma polysaccharide； thymus； spleen； cell apoptosis； cell proliferation

收稿日期：2013-03-29

基金項目：廣西大學動物科學技術學院科研發展基金項目（DK201102）；2011年新世紀廣西高等教育教改工程項目（2011JGB006）；廣西高等

學校特色專業及課程一體化建設項目（GXTSZY141）

作者簡介：周石瓊（1985-），女，四川巴縣人，助理獸醫師，碩士，主要從事組織胚胎學的研究，（電話）18983283859（電子信箱）86370764@qq.com；

通訊作者，王曉麗（1976-），女，內蒙古赤峰人，教授，主要從事細胞、組織與胚胎工程的研究，（電子信箱）lili-fly@126.com。

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum），又名七葉膽、甘茶蔓等，味苦、性寒、無毒。主要分布于中國南部，在廣西有豐富的資源。絞股藍具有抗疲勞、抗缺氧、減肥、抗衰老、抗潰瘍作用，并有抑制癌細胞增殖和膽結石形成的功效[1-4]。近年來的研究表明，絞股藍多糖具有非常重要的生物活性，在世界范圍內已經對絞股藍多糖的提取和其藥用價值進行了全面的研究，特別在其免疫效果的研究方面。但是大多數研究是就臨床效果進行臟器指數統計或是進行體外細胞培養從而驗證其免疫能力，而沒有從體內的細胞學角度進行研究。本試驗對小鼠胸腺和脾臟淋巴細胞的凋亡和增殖進行了研究，從組織學角度研究絞股藍多糖對小鼠免疫系統的影響，從而驗證絞股藍多糖的免疫性能，為其開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組情況

健康昆明種小白鼠40只，購于廣西醫科大學實驗動物中心，雌雄各半，體重18.00～22.00 g。隨機分為4組，每組10只，于實驗動物房標準鼠籠中飼養，自由采食、飲水，其他管理措施參照小鼠飼養管理手冊。其中1組為對照組，另外3組為試驗組。試驗組小白鼠分別注射不同濃度（50、100、200 mg/kg）的絞股藍多糖，每天腹腔注射0.5 mL/只，連續給藥7 d，對照組則注射等體積生理鹽水。各組動物于末次給藥后24 h脫臼處死，取胸腺和脾臟稱重記錄后分別進行固定。

1.2 藥品與試劑

絞股藍多糖：于廣西大學動物科技學院藥理實驗室提取；細胞凋亡原位檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）：Roche Applied Science，Cat.No.11 684 817 910；細胞增殖檢測試劑盒：中衫金橋（ZSGB-BIO）SP-9000/9001/9002 HistonstainTMPlis Kits；DAB試劑盒：中衫金橋（ZSGB-BIO）ZLI-9031/9032/9033；小鼠抗大鼠增殖細胞核抗原單克隆抗體：中衫金橋（ZSGB-BIO）ZM-0213。

1.3 試驗方法

絞股藍多糖含量測定：采用苯酚硫酸法。將絞股藍多糖0.1 g溶于1 000 mL的蒸餾水中，取2 mL溶液加入6%的苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm處測得吸光度值。以標準曲線計算得多糖含量。

臟器指數：小鼠脫臼處死后取其胸腺、脾臟，用濾紙吸干水分后即在分析天平上稱重，計算臟器指數。胸腺指數=胸腺重/體重；脾臟指數=脾臟重/體重。

胸腺、脾臟石蠟切片制作：梯度乙醇脫水、二甲苯∶乙醇（1∶1）浸透、二甲苯透明、石蠟包埋、修塊、切片（5 μm）、載玻片涂抹甘油蛋白撈片、50 ℃烘箱放置48 h。

原位末端標記（TUNEL）法試劑盒檢測：切片用二甲苯清洗2次，梯度乙醇復水，PBS漂洗2次，細胞通透液8 min，PBS漂洗2次，于暗濕盒中37 ℃孵育30 min，PBS漂洗2次，于組織處加50～100 μL DAB底物，15～25 ℃反應10 min，PBS漂洗2次，蘇木精復染幾秒鐘后用自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察，隨機選取10個視野，分別計數視野內的凋亡細胞數，求平均值并進行統計學分析，拍照。

SP試劑盒檢測：石蠟切片常規脫蠟至水，去離子水反應10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min，滴加試劑A（藍）于室溫下10～15 min，傾去，勿洗；滴加1∶100稀釋的一抗于37 ℃孵育2～3 h ，用PBS清洗3次，每次3 min；滴加試劑B（黃）于37 ℃孵育10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；滴加試劑C（橙）于37 ℃孵育10～15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；用 DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察，隨機選取10個視野 ，分別計數視野內的增殖細胞數，求平均值并進行統計學分析，拍照。

1.4 統計學分析

采用SPSS18.0 for windows 統計學軟件進行方差分析，計量數據用“平均數±標準差”表示，比較各組細胞凋亡率的差異。

2 結果與分析

2.1 絞股藍多糖含量測定

通過苯酚硫酸法測定樣品吸光度為0.47。通過圖1中標準曲線和回歸方程計算得其多糖含量為83.4%。

2.2 絞股藍多糖對小鼠臟器指數的影響

由表1可見，50 mg/kg和100 mg/kg絞股藍多糖對正常小鼠的脾臟指數有抑制作用，與空白對照相比差異極顯著（P<0.01），其中以50 mg/kg的絞股藍多糖的抑制作用最強。絞股藍多糖對小鼠胸腺指數沒有明顯影響。

2.3 染色結果

HE染色：可見正常淋巴細胞核染色呈藍色或紫色，染色質色澤均一。凋亡細胞胞核染色質固縮、邊集，呈花瓣狀、半月形或凋亡小體（圖2、圖3）。

原位末端標記（TUNEL）法檢測結果：視野內可見大量的TUNEL陽性細胞，其細胞核呈棕黑色，胞質為均勻的棕黃色；周圍正常細胞的細胞核呈米黃色（圖4、圖5）。

SP檢測結果：可見陽性細胞胞核呈棕色，凸顯于視野中，胞質勻染；周圍陰性細胞呈黃色，胞質均勻淡黃色（圖6、圖7）。

2.4 絞股藍多糖對小鼠脾臟和胸腺淋巴細胞凋亡的影響

由表2可見，在小鼠生理狀態下，50 mg/kg和200 mg/kg的絞股藍多糖對小鼠脾臟淋巴細胞凋亡有促進作用，與空白對照和100 mg/kg組相比差異極顯著（P<0.01），100 mg/kg的絞股藍多糖對小鼠脾臟淋巴細胞的凋亡沒有明顯影響，可能是注射藥物引起了脾臟的應激反應，加快了脾臟細胞的代謝所致。50 mg/kg和100 mg/kg絞股藍多糖對生理狀態下的小鼠胸腺細胞凋亡有促進作用，與空白對照和200 mg/kg組相比差異極顯著（P<0.01），其原因也可能是與藥物的刺激有關。

2.5 絞股藍多糖對小鼠脾臟和胸腺淋巴細胞增殖的影響

由表3可見，50 mg/kg和100 mg/kg的絞股藍多糖都能夠使脾臟淋巴細胞增殖增加，結合表2分析可知，絞股藍多糖能夠增加脾臟的代謝，增強脾臟細胞的更新。而50、100、200 mg/kg的絞股藍多糖對小鼠胸腺淋巴細胞的增殖均有顯著的影響（P<0.05或P<0.01），能夠增加胸腺淋巴細胞的數量，通過表2與表3綜合分析表明絞股藍多糖對胸腺和脾臟的細胞更新有刺激作用。

3 小結與討論

胸腺是機體最重要的淋巴器官，其功能與免疫緊密相連，其最主要的功能是產生T淋巴細胞，因此其功能狀態是否正常就直接影響到機體免疫狀況的好壞。而脾臟是機體中最大的淋巴器官，占全身淋巴組織質量的1/4，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，在異物入侵的時候可起到過濾的作用，在缺血的時候可起到補血的作用，在腫瘤發生的時候可起到抗腫瘤的作用，所以對其細胞狀況的觀察也是對機體免疫功能好壞評估的一種重要手段。本試驗是基于胸腺和脾臟在機體免疫中具有的重要地位而選取其作為免疫指標來對絞股藍多糖的免疫效果進行檢測。

對于生理狀態下多糖對機體免疫功能影響的研究已有很多，從植物多糖到動物多糖，其大多都具有免疫刺激的功能，并且在生理狀況下對細胞的凋亡和增殖同樣有影響。文貴輝等[5]在櫻桃谷鴨的飼料里加入了白術多糖，再檢驗其細胞增殖的狀況，結果表明添加白術多糖的櫻桃谷鴨細胞顯著增殖，而對其胸腺指數沒有顯著影響，脾臟指數在添加比例為0.6%時有顯著抑制作用。尚川川等[6]將淫羊藿多糖作為一種免疫佐劑用于雞新城疫的預防，通過免疫器官的指數測定，得出中劑量和高劑量的多糖對脾臟指數有促進作用。廉宜君等[7]從中藥方劑中提取出了復合多糖，并且對其免疫功能進行研究，得出該復合多糖能夠顯著提高脾臟指數和胸腺指數，并且與黃芪多糖組比較也存在顯著差異。董蘭鳳等[8]對附子多糖的抗腫瘤作用研究得知其能夠明顯增大小鼠脾臟的質量，能夠誘導腫瘤細胞的凋亡。王守山等[9]通過對蘆薈多糖的研究指出其能夠促進胸腺和脾臟的發育，特別是能促進胸腺的發育。樟芝多糖對小鼠的胸腺和脾臟指數都有顯著的影響，特別是高劑量組，而且其還能夠促進淋巴細胞的增殖，并呈現了劑量和效應的關系[10]。左旋咪唑黨參多糖能夠顯著提高雛雞的胸腺和脾臟指數，而且能夠使淋巴細胞顯著增殖，并且在高劑量時表現最為顯著[11]。在鬼臼多糖的研究中，通過不同濃度的鬼臼多糖與脾臟淋巴細胞的混合培養，用MTT法測得其增殖情況證明鬼臼多糖對淋巴細胞的增殖有促進作用[12]。王燁等[13]對海藻多糖進行研究，將其添加于水中讓肉雜雞飲用，觀察其對免疫性能的影響，結果表明其能顯著提高肉雜雞免疫器官的系數，特別是脾臟指數，也可提高血淋巴細胞數量，證明其能增強肉雜雞的免疫功能。王媛媛[14]通過流式細胞儀和TUNEL等方法對吉西他濱、人參多糖進行研究，得知其能夠抑制人A549細胞的增殖，通過Bcl-2的下調，表現為細胞G0/G1期的阻滯，從而使細胞產生凋亡，進而達到抑制腫瘤的作用。孫延慶等[15]通過形態學和流式細胞儀等方法研究梁金菇多糖，得知其在一定的劑量內具有誘導原代白細胞凋亡的作用。裙帶菜多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用十分明顯，高濃度的腫瘤抑制率可以達到69.13%，其淋巴細胞的殺瘤活性與對照組相比差異顯著，而在體內的抗Hca-F轉移模型中，裙帶菜多糖對轉移模型小鼠腫瘤細胞生長的抑制作用也很顯著，而且在流式細胞儀及免疫細胞化學分析下可知該多糖有很強的誘導細胞凋亡的作用[16]。茯苓多糖、豬苓多糖和黃芪多糖都能影響細胞內的鈣離子濃度，但是其作用時間和劑量沒有一定的相關性，通過對鈣離子濃度的影響，從而誘導細胞的凋亡[17]。對三種昆蟲多糖的研究表明其通過靜脈注射能夠提高免疫性能[18]。豬胎盤脂多糖能夠使體外培養的淋巴細胞的DNA和蛋白質的合成加強，促進淋巴細胞顯著增殖，在48 h時效果最為顯著[19]。絞股藍多糖對接種肝癌Heps的小鼠肝臟和胸腺沒有影響，但是對接種肉瘤S180的小鼠的脾臟有顯著刺激促進作用，而對兩種小鼠的淋巴細胞的轉化都沒有顯著影響[20]。絞股藍多糖能夠對環磷酰胺處理過的小鼠淋巴細胞的增殖產生強烈刺激作用，說明其對免疫抑制小鼠的細胞免疫功能具有促進作用[21]。

在本試驗中研究了絞股藍多糖對生理狀況下小鼠胸腺及脾臟的影響。在臟器指數方面，絞股藍多糖各劑量對小鼠的胸腺指數沒有影響，而對脾臟有刺激作用，在低、中濃度的時候是抑制脾臟的生長，使其指數降低，高濃度的時候則有促進作用。在細胞凋亡方面，低、中濃度的絞股藍多糖可使胸腺淋巴細胞的凋亡數增加，低、高濃度的膠股藍多糖可使脾臟淋巴細胞的凋亡數增加。同時，低、中濃度的絞股藍多糖對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖有促進作用，而低、中、高濃度的絞股藍多糖均可促進小鼠胸腺淋巴細胞的增殖。綜合分析可知絞股藍多糖既能促進胸腺和脾臟的細胞凋亡也可促進其增殖，即促進了胸腺和脾臟細胞的更新。

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（責任編輯 曾德芳）