響應面法優(yōu)化桂花總黃酮提取工藝

摘要：以桂花（Osmanthus fragrans）干粉為原料，采用索氏提取法從中提取總黃酮，考察乙醇溶液體積分數(shù)、液料比（V乙醇∶m桂花粉，mL/g）、提取時間對桂花中總黃酮提取率的影響，并利用Box-Behnken試驗設計進行響應面分析。結(jié)果表明索氏提取法提取桂花總黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇溶液體積分數(shù)83%、液料比29.8∶1、提取時間3.1 h，此條件下桂花中總黃酮提取率可達19.1%。

關鍵詞：桂花（Osmanthus fragrans）；總黃酮；索氏提取；響應面法

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4189-03

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Osmanthus fragrans Using Response Surface Method

SHI Yu-min1，YAN Heng2，CAI Zhao-hui1，CHEN Hong-guo1

（1.School of Nuclear Technology，Chemistry and Life Science， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437000，Hubei，China； 2.Hubei Provincial Center for Food Quality Supervision and Test Research， Wuhan 430030，China）

Abstract： Total flavonoids were extracted from flower of Osmanthus fragrans by Soxhlet extraction method. The effects of volume fraction of alcohol， liquid to solid ratio（Valcohol∶mosmanthus fragrans，mL/g）， extraction time on yield of flavonoids were studied. Response surface method was employed to optimize the extraction process. Results showed that the optimum conditions for Soxhlet extraction of total flavonoids were alcohol volume fraction， 83%； liquid to solid ratio， 29.8∶1； extraction time， 3.1 h. Extraction yield of total flavonoids was 19.1% under these conditions.

Key words： Osmanthus fragrans； total flavonoids； Soxhlet extraction； response surface method

收稿日期：2010-05-20

基金項目：湖北省自然基金重點項目（2011CDA063）；湖北省教育廳重點項目（CXY2009B043）；湖北省高等學校青年教師深入企業(yè)行動計劃

項目（XD20100662）；咸寧市科學技術研究項目（No.2010018）

作者簡介：史玉敏（1983-），女，山西太原人，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)工作，（電話）0715-8265089（電子信箱）77950561@qq.com；

通訊作者，陳洪國，（電話）0715-8265089（電子信箱）chhg1969@163.com。

黃酮類化合物[1]又稱類黃酮化合物[2]，是以α-苯基苯并吡喃酮為主體的一系列化合物的總稱，其主要類型有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、雙黃酮和異黃酮[3]。近年來有研究認為，部分黃酮類化合物以氫鍵形式與細胞膜結(jié)合，使細胞膜上的不飽和鍵不與自由基接觸，抗脂質(zhì)過氧化。正常生理狀態(tài)下，一氧化氮（NO）在舒張血管內(nèi)皮、維持機體血壓平衡方面起重要作用，但高濃度的NO能和活性氧反應后產(chǎn)生氧化能力更高的亞硝基自由基，導致細胞氧化損傷。如在缺血再灌注損傷時NO合酶活性增加，產(chǎn)生大量的NO而導致氧化損傷形成。研究發(fā)現(xiàn)許多黃酮類化合物包括槲皮素、姜黃素等在缺血再灌注損傷時可抑制NO合酶的活性，從而起到抗氧化作用[4]。本研究以湖北省咸寧市盛產(chǎn)的桂花（Osmanthus fragrans）為原料，采用索氏提取法提取其中的總黃酮[5]，通過單因素試驗[6]和響應面設計[7，8]對提取工藝進行優(yōu)化[9，10]，以期為黃酮類化合物的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 選取湖北省咸寧市金桂干花粉末為材料；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純；蘆丁標準品（色譜純，Sigma公司）。

1.1.2 試驗儀器 恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）；TU-1810型紫外-可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；索氏提取器（上海五一玻璃儀器廠）；球形冷凝管（上海五一玻璃儀器廠）；DHG-9053A型干燥箱（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精確稱取充分干燥至恒重的蘆丁標準品0.010 g，用80%（體積分數(shù)，下同）的乙醇溶液溶解并定容至20 mL，搖勻得濃度為0.5 mg/mL的蘆丁標準液。分別吸取蘆丁標準液0、1、2、3、4、5 mL于25 mL刻度試管中，用80%的乙醇補至10 mL，加入1 mL 50 mg/mL的亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min后加入1 mL 0.1 g/mL硝酸鋁溶液，放置6 min，再加入0.5 mL乙酸，用40 mg/mL的氫氧化鈉溶液定容至刻度，搖勻，室溫放置15 min后以80%的乙醇溶液為參比，于509 nm波長處測定吸光度[11]。以蘆丁標準溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。從圖1可以看出，蘆丁標準溶液在0.00～0.10 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為A=11.433 0 C-0.011 5，r2=0.999 2。

1.2.2 單因素試驗優(yōu)化桂花總黃酮提取工藝 以乙醇為提取溶劑，采用索氏提取法從桂花粉末中提取總黃酮，設置單因素試驗分別考察乙醇溶液體積分數(shù)、液料比、提取時間對總黃酮提取率的影響[12]。①乙醇溶液體積分數(shù)。準確稱取干燥處理好的桂花粉末5份，每份5.00 g，加入150 mL體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在索氏提取器中浸提3 h，浸提溫度70℃，測定提取液中的總黃酮含量，計算總黃酮提取率。②液料比。準確稱取預處理好的桂花粉末5份，每份5.00 g，分別按20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1的液料比（V乙醇∶m桂花粉末，mL/g，下同）加入體積分數(shù)80%的乙醇溶液作提取劑，在索氏提取器中浸提1 h，浸提溫度70 ℃，測定提取液中的總黃酮含量，計算總黃酮提取率。③提取時間。準確稱取預處理好的桂花粉末5份，每份5.00 g，加入150 mL體積分數(shù)80%的乙醇溶液作提取劑，分別在索氏提取器中浸提1、2、3、4、5 h，浸提溫度70 ℃，測定提取液中的總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

1.2.3 響應面法優(yōu)化桂花總黃酮提取工藝 根據(jù)Box-Behnken原理設計響應面試驗進一步考察桂花總黃酮提取工藝中乙醇溶液體積分數(shù)、液料比、提取時間3個因素對桂花總黃酮提取率的影響。具體響應面試驗因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇溶液體積分數(shù)對桂花總黃酮提取率的影響 以不同體積分數(shù)的乙醇溶液作提取劑，所得桂花總黃酮的提取率見圖2。由圖2可知，乙醇溶液體積分數(shù)由50%升高到80%，桂花總黃酮的提取率呈上升趨勢，而乙醇溶液體積分數(shù)為80%或90%時，桂花總黃酮提取率沒有明顯差異。

2.1.2 液料比對桂花總黃酮提取率的影響 以體積分數(shù)80%的乙醇溶液作提取劑，不同液料比對桂花總黃酮提取率的影響見圖3。由圖3可知，隨著液料比的升高，即提取劑用量的增大，桂花總黃酮提取率呈先上升后下降的變化趨勢，液料比為30∶1時桂花總黃酮提取率最高。

2.1.3 提取時間對桂花總黃酮提取率的影響 提取時間對桂花總黃酮提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著提取時間的延長，桂花總黃酮提取率呈先升高后降低的變化趨勢，提取時間為3 h提取率最高，之后再延長提取時間，提取率反而下降。

2.2 響應面試驗結(jié)果

響應面試驗結(jié)果見表2。采用SAS統(tǒng)計軟件進行二次多元回歸擬合，可以得到3個因素對響應面值的二階經(jīng)驗模型為Y=18.933 3+1.137 5 X1-0.100 0 X2+0.462 5 X3-1.766 7 X12-1.241 7 X22-2.016 7 X32。對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型的P<0.01，表明該模型是高度顯著的，決定系數(shù)r2=0.987 1，修正決定系數(shù)radj2=0.963 8，表明該模型相關度很好，能對試驗數(shù)據(jù)進行較好的擬和。模型中X1、X3、X12、X1X3、X22、X32的P均小于0.05，表明其對響應面值的影響達顯著水平。

對回歸方程取一階偏導等于零，并求解方程組得X1=0.321 9，X2=0.040 2，X3=0.114 7，即理論上在乙醇溶液體積分數(shù)83%、液料比29.8∶1、提取時間3.1 h的條件下，桂花總黃酮提取率最高，可達19.1%。在此條件下提取桂花總黃酮，重復3次，進行驗證試驗，所得總黃酮提取率分別為18.8%、19.1%、18.9%，與預測值非常接近，表明響應面試驗結(jié)果準確可靠。

3 小結(jié)與討論

本研究以湖北咸寧盛產(chǎn)的桂花為原料，通過單因素試驗分別考察乙醇溶液體積分數(shù)、液料比、提取時間對桂花中總黃酮總提取率的影響，采用Box-Behnken響應面試驗對總黃酮提取工藝進一步優(yōu)化，使用SAS軟件進行分析，確定最佳提取條件為乙醇溶液體積分數(shù)83%、液料比29.8∶1、提取3.1 h。此條件下總黃酮提取率可達19.1%。響應面分析法優(yōu)化得到的參數(shù)條件準確可靠，具有很好的實際應用價值。同時，因各參數(shù)的精確度都很高，在生產(chǎn)上可以根據(jù)實際情況進行調(diào)整。

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（責任編輯 向 闈）