大孔吸附樹脂分離純化冬凌草甲素條件的優化

摘要：比較了大孔吸附樹脂D-101、DM-130、AB-8和NKA-9對冬凌草甲素的吸附和解吸附能力。結果表明，AB-8樹脂對冬凌草甲素具有較好的吸附分離性能。其最佳分離純化工藝條件為，吸附時進料濃度0.486 mg/mL、流速2 BV/h、進樣量4 BV；解吸附時體積分數80%的乙醇溶液作洗脫劑、流速1.5 BV/h、洗脫劑用量3 BV。經AB-8樹脂吸附與解吸附后，冬凌草甲素回收率為78.4%；用甲醇重結晶后純度達到99.5%，回收率為54.3%。

關鍵詞：大孔吸附樹脂；冬凌草甲素；分離純化；吸附；解吸附

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4201-04

Optimization of Separation and Purification Conditions of Rubescensine A by Macroporous Adsorption Resin

YE Hong-yong，ZUO Guang-ling，LI Ru-lin

（Department of Biological and Chemical Engineering， Nanyang Institute of Technology， Nanyang 473004， Henan，China）

Abstract： The adsorption and desorption capacities of four kinds of macroporous adsorption resins， D-101， DM-130， AB-8 and NKA-9 were compared. The results showed that AB-8 resin had the best adsorption and desorption capability. And the optimum technology parameters for adsorption were feeding concentration 0.486 mg/mL， flow rate 2 BV/h and feeding volume 4 BV； for desorption were 80%（volume fraction） alcohol as elution solvent， flow rate 1.5 BV/h and elution volume 3 BV. After treated with AB-8， the yield of rubescensine A was 78.4%. And the purity of rubescensine A could be up to 99.5% if recrystallized by methanol， and the yield was 54.3%.

Key words： macroporous adsorption resin； rubescensine A； separation and purification； adsorption； desorption

收稿日期：2012-09-13

基金項目：河南省重點科技攻關項目（122102210481）

作者簡介：葉紅勇（1978-），男，河南南陽人，講師，碩士，主要從事天然產物活性成分的提取研究，（電話）0377-62076316（電子信箱）

yehongyong2009@163.com。

冬凌草（Isodon rubescens）又名碎米椏，為唇形科香茶屬多年生小灌木植物，廣泛分布于我國中部和南部，主產于河南太行山南麓濟源、焦作、鶴壁等地[1]。其主要成分二萜化合物冬凌草甲素（Rubescensine A）對腫瘤細胞有確切的殺傷、抑制增殖作用，主要用于治療食管癌、乳腺癌、直腸癌及賁門癌等腫瘤疾病[2]。目前，冬凌草甲素主要通過乙醇（或乙醚）回流提取、萃取、脫色、硅膠柱層析分離和結晶等工藝生產。然而由于冬凌草甲素為熱敏性成分，在回流提取時有效成分易發生變化[3，4]，而柱層析前的拌硅膠和裝柱工序操作勞動強度大，工業化生產受到限制[5，6]。近年來，大孔吸附樹脂被廣泛用于中草藥有效成分如黃酮[7]、多酚[8]、皂甙[9]等的分離富集以及中藥制劑的生產，而超聲波技術用于冬凌草甲素的提取可以避免高溫對冬凌草甲素有效成分的破壞[10]。本研究采用超聲波法提取冬凌草甲素，并進一步利用大孔吸附樹脂進行富集，探討了大孔吸附樹脂分離純化冬凌草甲素的最佳工藝條件和參數，為其開發應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬凌草（HPLC法測定冬凌草甲素含量為0.623%）購自河南省濟世藥業有限公司，冬凌草甲素對照品（純度>99.9%）由河南省生物研究所提供。D-101、DM-130、AB-8和NKA-9樹脂（天津市海光化工有限公司），玻璃層析柱（φ26 mm×600 mm，上海安瀾德生物科技有限公司），Prominence LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AL104型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）公司）。

1.2 冬凌草甲素提取液的制備

采用超聲波法提取冬凌草甲素，冬凌草干燥粉碎后過60目篩，準確稱取100 g冬凌草粉末，每次加入800 mL 95%（體積分數，下同）的乙醇，在500 W功率下超聲波提取3次，每次30 min，合并提取液，再加入30 g活性炭，超聲波脫色2次，每次15 min，濾液減壓濃縮至膏狀，用40%的乙醇在1 000 mL容量瓶中定容，HPLC法測得冬凌草甲素初始濃度C0為0.486 mg/mL。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜分析條件 Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，檢測波長240 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL，流動相為體積分數60%的甲醇溶液。

1.3.2 標準曲線的繪制 精確稱取10 mg冬凌草甲素對照品置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，作為對照品儲備液。取對照品儲備液配制36、59、98、121、162、198 μg/mL的系列對照品溶液。分別取10 μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y=6 073.43X-3.36，r=0.999 8，表明冬凌草甲素在36～198 μg/mL范圍內濃度與峰面積線性關系良好。

1.4 樹脂的預處理

樹脂先用95%的乙醇浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用95%的乙醇洗脫至流出液加5倍水不出現白色渾濁為止。去離子水洗盡乙醇，再用4倍樹脂體積的5%鹽酸浸泡2 h，去離子水洗至中性；再用50 mg/L氫氧化鈉浸泡2 h后用去離子水洗至中性，備用。

1.5 靜態吸附解吸附試驗

分別精確稱取0.5 g 4種干樹脂置于150 mL具塞錐形瓶中，再分別加入50 mL冬凌草甲素樣品溶液。25 ℃、110 r/min恒溫振蕩至吸附平衡（約12 h），利用HPLC法測定并計算各樣品溶液中冬凌草甲素的平衡濃度；離心除去冬凌草甲素溶液后，加入50 mL 80%的乙醇溶液，25 ℃、110 r/min恒溫振蕩12 h，測定洗脫液中冬凌草甲素的濃度，按下列公式計算各項指標：

Qe=■；

E=■×100%；

D=■×100%；

R=■×100%

式中，Qe為樹脂的平衡吸附量，mg/g；V1為冬凌草甲素樣品溶液體積，mL；C0為冬凌草甲素樣品溶液起始濃度，0.486 mg/mL；Ce為樣品溶液中冬凌草甲素的平衡濃度，mg/mL；m為干樹脂的質量，g；E為樹脂的吸附率，%；D為樹脂的解吸率，%；V2為解吸時加入的乙醇溶液體積，mL；C1為洗脫液中冬凌草甲素的濃度，mg/mL；R為冬凌草甲素的回收率，11%。

1.6 動態吸附和洗脫試驗

室溫下，冬凌草甲素樣品溶液以一定的流速通過裝有預處理后的樹脂的層析柱，測定流出液中冬凌草甲素的濃度，考察吸附液流速和進料濃度對樹脂吸附性能的影響，繪制泄漏曲線，確定樹脂的最佳吸附工藝條件。對已吸附冬凌草甲素的樹脂用乙醇溶液進行解吸附試驗，考察洗脫劑流速對樹脂解吸附性能的影響，并繪制解吸曲線，確定最佳洗脫液流速。

2 結果與分析

2.1 靜態吸附解吸附特性

2.1.1 大孔吸附樹脂的選擇 冬凌草甲素屬于弱極性化合物，根據類似物吸附類似物的原則，樹脂的極性是影響其吸附性能的重要因素。為了篩選出適合用于冬凌草甲素吸附分離的樹脂，對D-101、DM-130、AB-8和NKA-9 4種不同極性樹脂的靜態吸附解吸附性能進行了研究，結果見表1。從表1可以看出，隨著樹脂極性的增強，4種樹脂的吸附率逐漸升高，而解吸率則逐漸下降，說明樹脂極性越強對冬凌草甲素的吸附作用力越強，而解吸附時則越困難。綜合評價各種樹脂的吸附和解吸附性能，并結合回收率， AB-8樹脂對冬凌草甲素的分離純化效果最好，故選用AB-8樹脂對冬凌草甲素的分離純化工藝作進一步研究。

2.1.2 樹脂的吸附等溫曲線 稱取AB-8樹脂0.5 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL不同初始濃度的冬凌草甲素溶液，測定AB-8樹脂分別在25、35和55 ℃下的平衡吸附濃度Ce，以Ce和Qe分別為橫、縱坐標繪制曲線，結果如圖1所示。由圖1可知，在25～55 ℃范圍內平衡濃度相同時，AB-8樹脂的吸附量隨溫度下降而升高，可判斷冬凌草甲素在AB-8樹脂上的吸附為放熱過程，降低溫度可以促進AB-8樹脂對冬凌草甲素的吸附。因此，本試驗選取吸附溫度為25 ℃。

2.1.3 樹脂的靜態吸附動力學曲線 精確稱取1.0 g AB-8干樹脂置于150 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL冬凌草甲素乙醇初始溶液，在25 ℃、110 r/min恒溫振蕩。間隔一定時間取3 mL（V0）上清液測定冬凌草甲素濃度（Ci），并計算吸附量（Q），經i次取樣后，冬凌草甲素濃度（Ci）與吸附量（Q）的計算公式如下[11]：

Q=■

以吸附量Q為縱坐標、時間t為橫坐標繪制AB-8樹脂對冬凌草甲素的靜態吸附動力學曲線如圖2所示。由圖2可以看出，在開始吸附的1.5 h內，吸附量升高很快，2 h后開始趨于平緩，3 h以后基本不再變化。說明AB-8樹脂對冬凌草甲素的吸附在3 h內達到動態平衡，屬于快速吸附平衡。

2.1.4 洗脫劑的選擇 冬凌草甲素屬于貝殼杉烯二萜類化合物，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機溶劑，考慮到乙醚的易燃性和甲醇的毒性，本試驗選用乙醇溶液作為解吸劑。不同體積分數的乙醇溶液對冬凌草甲素的解吸附作用如圖3所示。從圖3可以看出，95%的乙醇作洗脫劑時冬凌草甲素的解吸率最大，達81.7%，且2 h內基本達到解吸附平衡。60%和70%的乙醇在4 h后解吸率都未能達到70.0%，解吸速率相對較慢。而80%的乙醇雖然解吸率沒有95%的乙醇的大，但在2.5 h內解吸率達到了78.0%，考慮到分離提純的經濟性，本試驗選用80%的乙醇作為洗脫劑。

2.2 動態吸附-解吸附特性

2.2.1 流速對泄漏曲線的影響 進料冬凌草甲素樣品溶液濃度為0.486 mg/mL，分別以1、2、3、4 BV/h的流速進樣，定時收集流出液，測定流出液中冬凌草甲素的濃度，并繪制泄漏曲線，結果如圖4所示。由圖4可知，流速較快時，流出液中冬凌草甲素濃度偏高，泄漏率也偏高。隨著流速的減緩，AB-8樹脂對冬凌草甲素的吸附率逐漸升高，這是因為流速低，樹脂與樣品的接觸時間長，傳質充分，吸附完全。但流速過小會導致生產效率降低，結合實際生產的需要，本試驗選定流速為2 BV/h。另外，從圖4還可以看出，在流速2 BV/h、進料體積約4.5 BV時，流出液濃度接近進料濃度的一半，出現嚴重的泄漏，因此進料體積以4 BV為宜。

2.2.2 進料濃度對泄漏曲線的影響 圖5為2 BV/h流速時不同進料濃度的冬凌草甲素樣品溶液的泄漏曲線。從圖5中可以看出，進料濃度高時，吸附傳質速度很高，吸附很快達到平衡。根據李坤平[12]的研究，吸附速度存在一個平衡值，吸附速度過快會造成AB-8樹脂對冬凌草甲素的吸附率不高，而進料濃度過低時吸附達到平衡的時間則很長。綜合吸附率和吸附時間兩方面的因素，本試驗選擇進料濃度為0.486 mg/mL。

2.2.3 洗脫液流速對解吸附曲線的影響 用80%的乙醇溶液分別以1.0、1.5、2.0和2.5 BV/h的流速連續洗脫已經吸附相同量冬凌草甲素的AB-8樹脂，解吸附曲線如圖6所示。從圖6可以看出，不同的洗脫速度對冬凌草甲素的洗脫效果有一定的影響，隨著洗脫劑流速的減緩，洗脫劑洗脫強度逐漸增加，洗脫曲線也逐漸變窄，在實際分離過程中可以提高冬凌草甲素的分離效率。另外，在流速為1.0和1.5 BV/h時，洗脫峰的峰形和峰高沒有太大的區別，而且流速為1.5 BV/h時只需3 BV的洗脫劑就可以將冬凌草甲素全部洗脫下來。考慮到縮短生產時間的需要，本試驗選用1.5 BV/h的流速為洗脫速度。

2.2.4 驗證試驗結果 按照上述優化出的最佳動態吸附-解吸附工藝條件進行驗證試驗，重復3次，所得冬凌草甲素的平均回收率為78.4%。洗脫液經減壓濃縮后加入適量甲醇熱溶解，冷卻后析出冬凌草甲素結晶，純度為96.0%，重結晶后純度可達到99.5%，此時回收率為54.3%。

3 小結與討論

1）通過比較4種大孔吸附樹脂對冬凌草甲素的靜態吸附和解吸附性能，確定AB-8可以有效地分離純化冬凌草甲素。動態吸附和解吸附試驗表明，AB-8對冬凌草甲素的回收率為78.4%；用甲醇重結晶后冬凌草甲素純度達到99.5%，回收率為54.3%。

2）AB-8樹脂純化冬凌草甲素的最佳工藝參數為吸附時進料濃度0.486 mg/mL、流速2 BV/h、進樣量4 BV；解吸附時80%的乙醇溶液作洗脫劑、流速1.5 BV/h、洗脫劑用量3 BV。

參考文獻：

[1] 李吉學，李燕杰，陳百泉.冬凌草甲素提取純化方法[J].河南大學學報（醫學版），2010，29（1）：10-12.

[2] 曾 蓉，易 莎，陳 燕，等.冬凌草甲素對多發性骨髓瘤細胞細胞周期和凋亡的影響及其機制研究[J]. 華中科技大學學報（醫學版），2011，40（5）：505-508.

[3] 戴 一，孫隆儒.冬凌草甲素、乙素的研究進展[J]. 食品與藥品，2008，10（9）：72-75.

[4] 王 寧，謝國祥，史曉浩，等.冬凌草甲素的提取工藝研究[J].中草藥，2003，34（10）：901-902.

[5] 袁 珂，楊中漢.HPLC測定微波提取冬凌草中的冬凌草甲素[J].華西藥學雜志，2006，21（5）：474-475.

[6] 趙 偉，郭兆霞.中壓柱層析法提取分離冬凌草甲素的新工藝[J].黑龍江醫藥，2001，14（1）：6-7.

[7] 董娟娥，梁宗鎖，張康健，等.大孔吸附樹脂一次性分離杜仲葉中杜仲總苷和杜仲黃酮的研究[J].農業工程學報，2006，22（7）：154-158.

[8] 張立華，張元湖，安春艷，等.石榴皮提取物的大孔樹脂純化及其抗氧化性能[J].農業工程學報，2009，25（1）：142-147.

[9] 孫曉博，張 凱，李蘭林，等.大孔吸附樹脂分離純化單葉鐵線蓮總皂苷的研究[J].中草藥，2011，42（10）：1977-1981.

[10] 袁 珂，呂潔麗，賈 安.超聲波提取-HPLC法測定冬凌草中冬凌草甲素[J].中草藥，2005，36（12）：1823-1824.

[11] 李 華，趙振貴，李 丹，等.大孔樹脂對大豆異黃酮的吸附性能研究[J]. 鄭州大學學報（工學版），2011，32（2）：19-22.

[12] 李坤平. 大孔樹脂吸附黃芩黃酮和布渣葉黃酮的應用基礎研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2010.