甘薯WRKY基因家族序列的分離與鑒定

摘要：根據WRKY基因家族序列的保守區域設計簡并引物，從甘薯（Ipomoea batatas L.）品種徐薯18中擴增出WRKY基因家族，經克隆、測序后得到15條WRKY基因家族序列，其編碼的氨基酸序列包含有WRKY基因家族所具有保守的WRKYGQ和TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q）區。對甘薯WRKY基因家族氨基酸序列與部分植物WRKY基因家族氨基酸序列進行聚類分析，發現其聚為5類，相似性較高，推測各類中相似性較高的序列分別屬于同一個基因家族。

關鍵詞：甘薯（Ipomoea batatas L.）；WRKY基因家族；簡并引物；分離；鑒定

中圖分類號：S531 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4241-04

Isolation and Identification of WRKY Gene Family from Sweet Potato

WANG Lian-jun，LEI Jian，SU Wen-jin，YANG Xin-sun

（Institute of Food Corps， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract：The degenerate primers designed from the conserved motifs in the WRKY gene family were used to amplify WRKY gene family from Ipomoea batatas， Xushu18. 15 WRKY gene family were obtained according to cloning and sequencing， and the amino acid sequence contained WRKYGQ and TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q） motifs of the WRKY. Cluster analysis of the predicted amino acid sequences grouped the WRKY of Ipomoea batatas and the known WRKY in NCBI database into five classes， and the sequence similarity was high. It was deduced that the RGAs with high similarity belonged to one gene family.

Key words： sweet potato（Ipomoea batatas L.）； WRKY gene family； degenerate primers；isolation；identification

收稿日期：2013-07-16

基金項目：公益性科技研究項目（2012DBA53001）；國家現代甘薯產業技術體系建設項目（CARS-11-C-15）；湖北省農業科技創新中心資助項目

（2007-620-001-03）；湖北省農業科學院青年基金項目；湖北省農業科學院特色學科項目

作者簡介：王連軍（1982-），男，河南新鄉人，助理研究員，博士，研究方向為植物遺傳育種，（電話）15377503092（電子信箱）wanglianjun10@163.com；

通訊作者，楊新筍，男，研究員，主要從事甘薯育種與栽培研究工作，（電子信箱）yangxins013@163.com。

甘薯（Ipomoea batatas L.）是世界上重要的糧食、飼料、工業原料及新型能源用塊根作物。中國是世界上最大的甘薯生產國，常年種植面積550萬hm2，鮮薯產量約1.2×108 t，分別占世界甘薯種植總面積和總產量的60%和85%[1]。甘薯在遺傳上高度雜合，種內、種間雜交不親和、遺傳資源匱乏，遺傳基礎狹窄以及病蟲害、病毒病危害嚴重，嚴重制約了甘薯品種的遺傳改良[2]。近年來，許多研究表明通過基因工程手段能夠改善甘薯的抗病和抗逆能力[3-6]。WRKY轉錄因子是近年來在植物中發現的一類鋅指型轉錄因子基因家族，其序列的N-端含有高度保守的WRKYGQ氨基酸序列。WRKY轉錄因子能夠與C/TTGACC/T序列（W-box）發生特異性結合，從而調節基因的表達[7]。WRKY轉錄因子廣泛參與植物對生物和非生物脅迫應答反應，包括對根結線蟲、真菌、病毒、NaCl、PEG、低溫、高溫、機械刺激以及低磷等逆境脅迫因子的響應[8-20]。另外，也有研究表明WRKY基因家族參與激素的信號轉導過程，如白菜型油菜中的WRKY基因受ABA誘導[21]。

本研究基于WRKY轉錄因子的保守區域設計簡并引物，PCR擴增獲得15條甘薯WRKY類轉錄因子基因片段，均含有WRKY轉錄因子的保守結構域，然后將其導入甘薯栽培種中，為提高甘薯抗病抗逆性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為高抗根腐病甘薯品種徐薯18[22]，種植于湖北省農業科學院糧食作物研究所，采集新鮮幼嫩葉片用于植物基因組DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 甘薯WRKY基因家族序列的PCR擴增 用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取甘薯品種徐薯18的基因組DNA。根據WRKY基因家族的氨基酸保守結構域WRKYGQ和TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q）設計簡并引物[23-25]。

PCR反應體系為：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTPs（10 mmol/L） 4 μL，上、下游引物各1.0 μL，基因組 DNA（50 ng/μL） 1 μL，EASY-Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O補至總體積為25 μL。PCR反應在TP-600型梯度PCR儀上進行，反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，42 ℃退火45 s，72 ℃延伸150 s，39個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察并拍照。

1.2.2 甘薯WRKY基因家族序列的克隆與序列分析 使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收擴增得到的目的片段，連接pMD19-T載體，轉化入大腸桿菌感受態細胞，進行目標片段的克隆，操作按照試劑盒說明進行。將陽性克隆送至上海英駿生物技術有限公司進行測序，在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行BLAST同源性比對，采用DNAMAN軟件對獲得的序列和數據庫中已知物種WRKY基因家族基因編碼的氨基酸序列進行分析，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 甘薯WRKY基因家族序列的擴增

利用簡并引物從甘薯品種徐薯18基因組DNA中擴增獲得集中于750 bp的彌散條帶（圖1）。為進一步分析擴增產物，對彌散條帶進行了回收和克隆，共得到50個陽性克隆。

2.2 甘薯WRKY基因家族核苷酸序列的比對分析

BLAST同源性比對結果表明，有15個片段與NCBI中已登錄的植物抗病基因及同源序列具有一定的同源性，可見利用簡并引物進行同源擴增是分離甘薯WRKY基因家族序列的有效方法。有2個區域相對保守，前面一段區域為45個堿基，后面一段區域為110個堿基，PCR擴增使用模板為基因組DNA，推測中間序列為內含子序列（圖2）。序列Ib241在后面一段區域多出了一個堿基T，由于該堿基的插入造成這一位置之后的一系列編碼發生移位錯誤，其結果是在插入堿基T之后開始合成和正常完全不同的氨基酸序列（圖2，星號標注出差異）。

2.3 甘薯WRKY基因家族氨基酸序列的比對分析

利用DNAMAN軟件將剩余的15條序列中間的內含子序列去除，推導演繹出氨基酸序列，所有的序列長度均為155個堿基，編碼51個氨基酸。推導的氨基酸序列均具有WRKYGQ和TTYEGKH（T/N/S/G/A/D）（H/Q）保守結構域（圖3），這是WRKY轉錄因子共有的特征序列，據此可確定這15條序列均為WRKY基因家族序列。將擴增得到的WRKY基因家族序列和數據庫中檢索到的8條已知物種的WRKY基因家族序列進行同源性比對，構建系統發育樹（圖4）。

由圖4可知，這些序列聚成5大類，第Ⅰ類為Ib26、Ib156和Ib247；第Ⅱ類為Ib16、Ib41、Ib148、Ib162、Ib174、GmWRKY35（大豆，Glycine max）、PmWRKY112（白松，Pinus monticola）、VvWRKY20（葡萄，Vitis vinifera）、 Ib184和Ib246；第Ⅲ類為Ib172、Ib-188和Ib-245、NtWRKY4（煙草，Nicotiana tabacum）、；Ibspf1、NbWRKY8（本生煙，Nicotiana benthamiana）；第Ⅳ類為NbWRKY2（本生煙）；第Ⅴ類為Ib-141、Ib-182和DIWRKY29-2。

3 討論

植物具有復雜的基因表達調控體系抵御病原物的侵染，并且主要通過轉錄水平上的調控來實現，WRKY轉錄因子家族在調控基因的表達和對外界環境生物和非生物脅迫的反應中起著重要作用[8]。WRKY轉系因子在調控與植物防御反應相關基因的表達上起著非常重要的作用。許多防御相關的基因，如PR、NPR1基因，啟動子區域都包含W-box[24]。本研究試驗材料為甘薯品種徐薯18，其高產穩產、適應性廣、綜合性狀好，具有高抗根腐病的特性[22]。WRKY轉錄因子序列的獲得將有助于揭示其高抗根腐病的機理。

內含子是斷裂基因中的非編碼區序列，其中，真核基因前體mRNA的內含子是最常見的內含子，在mRNA轉錄加工后被切除掉，起初人們認為內含子沒有功能。但近年來的許多研究發現，有些真核基因的內含子在基因表達中具有相當重要的作用，甚至有些基因的表達需要內含子參與[25，26]。本研究發現所有15條WRKY基因家族序列具有長度不同的內含子，這些長度不同的內含子存在可能調控著該家族基因的表達。

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（責任編輯 屠 晶）