NaOH預處理小麥秸稈對纖維素酶水解的影響

摘要：以小麥秸稈為底物，對不同NaOH預處理條件下小麥秸稈的纖維素酶水解效率進行了研究，考察因子包括NaOH質量分數、小麥秸稈固體含量、預處理時間，同時利用掃描電子顯微鏡（SEM）分析了酶水解過程中小麥秸稈的結構變化。結果表明，在NaOH質量分數為1.00%、小麥秸稈固體含量為0.050 g/mL、預處理時間為60 min時，小麥秸稈的糖化效率最高，總還原糖的產率達到86.61%，較未處理時產率提升74.60個百分點。利用最佳預處理條件下的小麥秸稈進行同步糖化發酵，其乙醇產率達到71.70%，較未處理時產率提升49.30個百分點。

關鍵詞：小麥秸稈；糖化發酵；NaOH預處理

中圖分類號：TQ353 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4355-04

第二代生物質乙醇是利用不同的原料如木材、農業或者森林廢棄物來生產，纖維素乙醇作為一種重要的可再生能源，具有能夠支撐全球能源消耗20%～100%的潛力。在纖維素乙醇的生產過程中非常重要的一步就是將半纖維素和纖維素水解為單糖，目前最具發展前景的水解方法為纖維素酶水解。為了使纖維素酶能夠與纖維素有效接觸，需要在水解之前對木質纖維素材料進行預處理，解除木質素、半纖維素等對纖維素的保護作用，同時破壞纖維素的結晶結構，增加其比表面積[1]，從而提高纖維素的水解糖化效率。

NaOH溶液的潤漲處理是發現最早、應用最廣的預處理手段之一，其處理溫度和壓力都低于其他預處理手段[2]。NaOH預處理打開了交聯木質素和木聚糖的酯鍵，能夠部分溶解原料中的木質素、半纖維素，降低纖維素的結晶度，同時增大了木質素材料的比表面積，能夠得到較高的酶解糖化率，是一種較為有效的預處理方法[3]。

本試驗使用NaOH溶液對小麥秸稈進行預處理，分別研究了NaOH質量分數、小麥秸稈固體含量、預處理時間等因素對小麥秸稈纖維素酶水解過程的影響，得到了最佳的NaOH預處理條件，之后對經最佳條件預處理后的小麥秸稈進行了同步糖化發酵試驗，并在電子顯微鏡下觀察了預處理前后的秸稈結構變化，進一步明確了NaOH預處理的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 小麥秸稈取自太湖農村，機器收割，不含秸稈根部和麥穗。

1.1.2 酶制劑 纖維素酶購自Sigma公司，為淡黃色液體纖維素酶。

1.1.3 酵母菌 試驗所用酵母為釀酒酵母BY4742， 于4 ℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 小麥秸稈預處理 小麥秸稈粉碎后過80目篩，烘箱中55 ℃干燥，設置不同質量分數的NaOH、小麥秸稈固體含量及預處理時間，在121 ℃、0.2 MPa的條件下在高壓滅菌鍋中進行預處理。預處理結束后冷卻至室溫，加入適量的稀鹽酸調節pH至中性，之后使用高速離心機進行離心并清洗3～5次。預處理后的小麥秸稈于105 ℃烘干，保存于干燥皿中備用。

1.2.2 纖維素酶水解 分別取未經預處理以及經NaOH預處理的秸稈各4.0 g，定容至100 mL，根據本課題組前期研究結果[4]，選取纖維素酶投加量為30 FPU/g秸稈，溫度40 ℃，檸檬酸鹽調節pH為4.8，共水解120 h，每隔24 h取樣1次，離心后取上清液進行HPLC分析。

1.2.3 同步糖化發酵 根據本課題組關于同步糖化發酵條件的研究，分別取未經預處理以及最優條件下NaOH預處理后的秸稈各1.6 g，確定固體含量為0.16 g/mL，纖維素酶投加量為35 FPU/g秸稈，酵母菌濃度8 g/L，檸檬酸鹽調節pH為4.0，溫度設置為38 ℃，同步糖化發酵120 h，每隔24 h取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 小麥秸稈成分分析 小麥秸稈纖維素、半纖維素和木質素含量的測定采用NREL實驗室提供的方法[5]。

1.3.2 還原糖及乙醇含量測定 樣品中纖維二糖、葡萄糖、木糖、乙醇濃度采用Shimadzu高效液相色譜分析儀檢測，檢測器為示差折光檢測器，色譜柱為Aminex HPX-87P Column。檢測條件：柱溫65 ℃，檢測器溫度60 ℃，流動相為超純水，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL。

1.3.3 小麥秸稈結構分析 采用電鏡掃描觀察。樣品在室溫風干之后平鋪于導電膠上，進行離子濺射金處理45 s，用JSM-7401F場發射掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4 計算公式 纖維素水解產生葡萄糖的化學方程式如方程式（1）所示，理論上，100 g纖維素水解可產生111.1 g葡萄糖。葡萄糖發酵產乙醇的化學方程式如方程式（2）所示，理論上，100 g葡萄糖發酵可產生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。由此可知，100 g纖維素理論上可產生56.8 g乙醇。

2 結果與分析

2.1 不同NaOH預處理條件對小麥秸稈酶解效果的影響

2.1.1 NaOH對小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗首先考察了不同質量分數的NaOH預處理條件下，纖維素酶水解小麥秸稈的效果。分別以0.25%、0.50%、1.00%、2.00%和4.00%的NaOH溶液預處理已粉碎干燥的小麥秸稈，之后進行120 h的水解試驗，并每隔24 h取樣進行還原糖含量分析。經不同NaOH溶液預處理后小麥秸稈水解產物中還原糖情況如圖1所示。預處理過的小麥秸稈經過酶解后，主要產生了纖維二糖、葡萄糖、木糖3種還原糖，由圖1可以看出，隨預處理NaOH質量分數的增加，酶解液的還原糖含量逐漸升高，其產量均在NaOH質量分數為1.00%時達到最高，其中葡萄糖含量在酶水解48 h時達到最高，為14.13 g/L。之后NaOH質量分數繼續增大時，還原糖產量開始下降，可能因為在預處理過程中NaOH溶解半纖維素和木質素的同時也水解了部分纖維素，還原糖進入了液相，在進行固液分離時損失[6-8]。

2.1.2 固體含量對小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗設置預處理時的小麥秸稈固體含量分別為0.025、0.050、0.100、0.150和0.200 g/mL，采用在“2.1.1”方法中確定的NaOH預處理最佳質量分數1.00%對小麥秸稈進行預處理，之后進行120 h的酶解試驗，每24 h取樣測定其還原糖含量。不同固體含量下NaOH預處理產物中還原糖含量如圖2所示。由圖2可見，預處理過程中在小麥秸稈固體含量提高到0.050 g/mL時，酶解液中的3種還原糖含量均達到最高。其中葡萄糖在纖維素酶水解48 h時其濃度達到最大值14.13 g/L。之后固體含量繼續增大時，其還原糖產量下降。分析其原因可能是預處理過程中固體含量對預處理強度產生影響，固體含量過高時，因NaOH溶液的量相對減少，難以與秸稈充分接觸，從而影響了預處理效果[9，10]。

2.1.3 預處理時間對小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗設置預處理時間分別為15、30、50、60和90 min，采用“2.1.1”方法得到的預處理最佳NaOH質量分數1.00%和“2.1.2”方法得到的最佳固體含量0.050 g/mL對小麥秸稈進行預處理，之后進行120 h酶解，每隔24 h取樣測定其還原糖產量。不同預處理時間下3種還原糖的產量如圖3所示。

由圖3可見，隨著預處理時間的增加，小麥秸稈酶解液3種還原糖含量在60 min時達到最大。其中葡萄糖濃度在酶水解24 h后達到最大值15.30 g/L。預處理50 min以上時，NaOH溶液對木質素和半纖維素的溶解基本完成，纖維素充分暴露出來，預處理時間增加到60、90 min時，酶解產生還原糖的濃度變化不大，考慮到增加預處理時間會顯著增加能耗，故將60 min確定為最佳預處理時間。

2.2 NaOH預處理對小麥秸稈酶解效果的影響

通過上述試驗可以得到NaOH預處理小麥秸稈的最佳條件為NaOH質量分數1.00%，小麥秸稈固體含量0.050 g/mL，預處理時間60 min。將經過預處理的小麥秸稈殘渣酶解120 h，其反應進程見圖4。

由圖4可知，在最佳預處理條件下，酶解24 h時，酶解液總還原糖產量達到最大，為34.65 g/L，其產率為86.61%。而未經預處理的小麥秸稈在酶解剛開始時總還原糖產量便開始下降，最高僅為4.80 g/L，其產率僅為12.01%。最佳預處理條件下的總還原糖產率也明顯高于常規的稀堿預處理的總還原糖產率[3]。這是因為NaOH預處理對半纖維素和木質素均有較好的去除效果，解除了木質素和半纖維素對纖維素的保護作用，同時破壞纖維素大分子之間的結晶結構，增大了小麥秸稈的比表面積，改善了底物與纖維素酶的接觸效果，同時也有效減少了木質素對纖維素酶的特異性吸附，使纖維素酶可以充分作用于底物，有效提高了小麥秸稈的酶解效果[11，12]。

2.3 小麥秸稈成分分析

使用NREL實驗室的方法分別測定未經NaOH預處理的小麥秸稈與經過最優條件預處理過的小麥秸稈成分，結果如表1所示。由表1可見，小麥秸稈在經過了最優條件預處理后，木質素的含量由25.73%降低至11.75%，同時纖維素的含量由39.31%升高至58.84%。表明NaOH能夠提高纖維素在底物中所占比例，同時降低木質素等所占比例[13]，有利于后續酶解進程。

2.4 同步糖化發酵結果

未經NaOH預處理的小麥秸稈與經過最佳條件預處理的小麥秸稈經同步糖化發酵后上清液成分如表2所示。

由表2可見，未經NaOH預處理的小麥秸稈由于結晶以及木質結構的保護，酶解過程受到抑制，進而影響了酵母菌對還原糖的發酵。而經過最佳NaOH預處理條件處理后，乙醇的產量大幅上升，由處理前的7.98 g/L上升到38.32 g/L，乙醇產率由22.40%上升至71.70%，無法被酵母菌利用的木糖含量也由處理前的0.80 g/L上升到了12.94 g/L。

由此可見，NaOH預處理不僅能夠有效去除木質素，而且基本不影響纖維素[14]，纖維素可以進一步水解并發酵產生乙醇，NaOH預處理是一種高效的木質纖維素產乙醇的預處理方法。

2.5 NaOH預處理前后小麥秸稈結構分析

小麥秸稈粉末在NaOH溶液質量分數為1.00%、固體含量0.050 g/mL、121 ℃、0.2 MPa的條件下預處理60 min，恢復至室溫干燥后備用。同時準備一份未經預處理的小麥秸稈粉末，干燥后備用。樣品平鋪在導電膠上，噴金45 s后用掃描電鏡觀察，其SEM結果如圖5所示。

由圖5可見，未經NaOH預處理的小麥秸稈表面光滑，纖維排列比較整齊，沒有明顯的破損和孔隙，結構致密。經過NaOH預處理后的小麥秸稈的半纖維素、纖維素和木質素的部分結構遭到破壞、分離，纖維和纖維束出現卷曲和折疊，變得柔軟疏松，排列凌亂；秸稈表面由預處理前的致密變得疏松，有序排列變得雜亂無章；原來光滑的表面上出現了片狀的物質，這可能是溶出的半纖維素和木質素[15]。經過預處理的小麥秸稈的比表面積大大增加，這更有利于纖維素酶的吸附，有利于水解，從而提高了酶水解液中還原糖的得率。

3 結論

1）NaOH預處理小麥秸稈的最佳條件為：NaOH質量分數1.00%，小麥秸稈固體含量0.050 g/mL，預處理時間60 min。

2）經過NaOH預處理的小麥秸稈水解液還原糖得率可提升74.60個百分點。

3）通過SEM觀察發現，經過NaOH預處理后，秸稈表面變得粗糙，有利于纖維素酶的吸附及進一步水解。

4）經過最佳條件NaOH預處理的小麥秸稈進行同步糖化發酵其乙醇產率提高了49.30個百分點。

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