龍葵內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定和多樣性研究

摘要：采用16 S rDNA PCR-RFLP和16 S rDNA基因全序列分析的方法，對(duì)從龍葵植株中分離得到的37株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多相分類和系統(tǒng)發(fā)育研究，結(jié)果顯示共有18種16 S rDNA基因型，在系統(tǒng)分類上歸屬于8個(gè)屬，分別為短桿菌屬（Brevibacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）。其中，菌株S-30與模式菌株Brevibacterium frigorito-lerans DSM8801T 的相似度僅為94.9%，是一個(gè)潛在的新種。試驗(yàn)結(jié)果揭示了龍葵根、莖、葉組織中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育地位。

關(guān)鍵詞：龍葵；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性； 16 S rDNA PCR-RFLP；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）18-4382-03

龍葵隸屬茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum），又稱野葡萄、天茄子、黑星星、苦菜、苦葵等，廣泛分布于歐洲、亞洲、美洲的溫帶至熱帶地區(qū)[1]。中國(guó)龍葵有3個(gè)種和1個(gè)變種，分別為龍葵（S. nigrum）、少花龍葵（S. paucifloum）、紅果龍葵（S. alatum）和黃果龍葵（S. nigrum var. flavovirns）[2，3]。龍葵為重要的藥用植物，具有清熱解毒、活血、利尿、消腫等功能，其化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用等研究越來(lái)越受到重視，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)龍葵具有較多藥理活性，包括抑制癌變作用等[4，5]。

內(nèi)生菌在植物健康組織內(nèi)普遍存在，包括真菌、細(xì)菌、放線菌等，但不會(huì)引起植物組織出現(xiàn)明顯侵染癥狀[6，7]。內(nèi)生細(xì)菌能夠獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，是天然藥用代謝產(chǎn)物的重要潛在來(lái)源[8-11]，還可以通過(guò)自身的代謝產(chǎn)物并借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用影響植物的生長(zhǎng)[8]。藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的研究對(duì)于藥用植物的栽培、藥性、藥理作用和新藥的開發(fā)研究具有很重要的意義。

目前對(duì)龍葵的研究主要集中在植株本身化學(xué)成分的檢測(cè)、分離、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面，而對(duì)該類植物內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定和多樣性的研究未見報(bào)道。為此，對(duì)龍葵的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定和遺傳多樣性分析，為進(jìn)一步研究龍葵活性物質(zhì)提供菌種資源，也為探討內(nèi)生菌與龍葵植株之間的關(guān)系及其栽培技術(shù)的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 龍葵樣品采集及內(nèi)生菌分離

采集西北農(nóng)林科技大學(xué)中草藥苗圃新鮮龍葵植株，先將其根、莖、葉切成長(zhǎng)約0.5 cm的小段，置于干凈的培養(yǎng)皿中，經(jīng)過(guò)5%次氯酸鈉和70%乙醇表面消毒，果實(shí)消毒后壓碎，接種于牛肉膏培養(yǎng)基上（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1 000 mL，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2），倒置于培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)3 d，待平板中長(zhǎng)出菌落，純化菌落3～4次，鏡檢以保證所得為純培養(yǎng)，然后斜面培養(yǎng)保存[12，13]。

1.2 16 S rDNA PCR-RFLP分析

1.2.1 總DNA的提取 供試菌株經(jīng)活化后接種于TY培養(yǎng)液中，28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，8 000 r/min離心收集菌體，用TE（10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）洗滌3次，溶菌酶破壁，蛋白酶處理，酚+氯仿+異戊醇抽提，乙醇沉淀，風(fēng)干，最后溶于雙蒸水中。用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白吸光法檢測(cè)DNA樣品的濃度和純度[14]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以總DNA為模板，選用來(lái)源于E. coli 16 S rDNA基因序列保守區(qū)域的兩段引物P1和P6配制成10 μmol/L濃度。正向引物P1：5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAC

GCT-3′；反向引物P6：5′-CGGGATCCTACGGCTAC

CTTGTTACGACTTCACCCC-3′。分別對(duì)應(yīng)于E. coli的第8～37堿基位置和第1 479～1 506堿基位置。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存[14]。

1.2.3 PCR-RFLP分析 10 μL 16 S rDNA PCR產(chǎn)物分別加入4種限制性內(nèi)切酶（HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ和HhaⅠ），37 ℃酶切3～4 h，酶切產(chǎn)物80 V電壓3%瓊脂糖凝膠電泳3～5 h，EB染色并照相，再對(duì)4種限制性內(nèi)切酶酶切圖譜進(jìn)行組合，每1種組合為1個(gè)16 S rDNA遺傳圖譜類型，酶切圖譜條帶完全相同的為1種遺傳類群[15]。

1.3 16 S rDNA全序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)16S rDNA PCR-RFLP遺傳圖譜組合類型，從每個(gè)類型中任選1株代表菌株進(jìn)行16 S rDNA測(cè)序。將測(cè)得的16 S rDNA的全序列與從GenBank （NCBI）中獲得的已知模式菌種進(jìn)行序列比較，用SeqPup 0.5軟件錄入，數(shù)據(jù)經(jīng)編輯后用DNAstar和MEGA軟件包分析，采用Neighbor-joining方法構(gòu)建以16 S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，并使用EzTaxon server 2.1比對(duì)測(cè)試菌株間16 S rDNA序列的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍葵內(nèi)生細(xì)菌分離統(tǒng)計(jì)

從龍葵植株的不同組織中共分離到37株內(nèi)生細(xì)菌株，其分布為根部15株，數(shù)量最多，其次是莖部13株，葉部較少，為9株，果實(shí)中未分離出內(nèi)生菌。

2.2 16 S rDNA PCR-RFLP分析

37株內(nèi)生菌的16 S rDNA PCR-RFLP結(jié)果分析見表1。4種限制性內(nèi)切酶酶切后，分別獲得13、14、8、9種限制性內(nèi)切酶酶切圖譜類型。37株菌株的16 S rDNA 4種限制性內(nèi)切酶酶切圖譜類型有18種不同的組合，即18種16 S rDNA基因型，說(shuō)明內(nèi)生菌的16 S rDNA基因具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 16 S rDNA全序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)不同基因型代表菌株16 S rDNA的全序列與其模式株構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。從發(fā)育樹可以看出，供試內(nèi)生細(xì)菌在系統(tǒng)分類上歸屬于4門8屬15種。其中，S-30與參比菌株Brevibacterium frigoritolerans DSM8801T的16S rDNA序列相似度僅為94.9%，可能是一個(gè)潛在的新種。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)對(duì)龍葵的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，從結(jié)果來(lái)看，龍葵的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)目少，種類較多，分屬于4門8屬15種，還有1個(gè)潛在的新種，說(shuō)明龍葵內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的遺傳多樣性。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)植株的不同組織部位所分離菌株的數(shù)目存在差異，根部最多，其次為莖部和葉部，果實(shí)中未分離到內(nèi)生細(xì)菌。這可能是由于根際環(huán)境為微生物的生長(zhǎng)提供了適宜的生存條件，龍葵果實(shí)中含有一定量的龍葵素，可能會(huì)抑制內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)[17]，也有可能是內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主的選擇性及適應(yīng)性所導(dǎo)致的結(jié)果。另外，培養(yǎng)條件和消毒方法也可能造成菌株的丟失，因此，優(yōu)化和改良培養(yǎng)條件或者在體外模擬宿主體內(nèi)的生存環(huán)境也能有助于分離得到更多的內(nèi)生細(xì)菌。

試驗(yàn)從龍葵植株中分離到的內(nèi)生細(xì)菌，包括大量的芽孢桿菌、短波單胞菌、不動(dòng)桿菌、鞘脂桿菌等，這些內(nèi)生細(xì)菌可能對(duì)龍葵植株的生長(zhǎng)具有重要的意義，也可能與龍葵的藥用活性有一定的關(guān)系。龍葵的內(nèi)生細(xì)菌具有較高的遺傳多樣性。本研究為豐富內(nèi)生菌的資源多樣性、確定其系統(tǒng)分類地位，為新功能優(yōu)良菌株的選育以及對(duì)于中草藥龍葵的優(yōu)化栽培和進(jìn)一步研究藥理作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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