五峰馬里蘭煙空莖病病原鑒定

摘要：在實驗室對從五峰馬里蘭煙空莖病病株分離的病原菌進行了形態學觀察、致病性鑒定和部分生物學特性研究。結果表明，分離物在LB培養基上的菌落淡黃色，圓形或不定形，表面光滑，微凸起，半透明，邊緣整齊。在電鏡下觀察，菌體短桿狀，大小（0.5～1.0） μm×（2.2～3.0）μm，周生鞭毛2～8根，無莢膜，不產生芽孢，革蘭氏染色陰性。在結晶紫果膠酸鹽（CVP）培養基上產生杯狀凹陷。病菌能在5%鹽濃度下生長，能在37 ℃下生長，能利用蔗糖發酵產酸，兼性厭氧，能利用檸檬酸鹽，但不能產生吲哚。結合該菌形態學特征、致病性和部分生物學特性，初步確定引起五峰馬里蘭煙空莖病的病原為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）。

關鍵詞：五峰馬里蘭煙；煙草；空莖病；病原鑒定；胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種

中圖分類號：S435.72 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4388-02

五峰馬里蘭煙是湖北省宜昌市煙草公司1981年從美國引進的低焦油含量煙草品種，現定名為五峰1號[1]，作為優質煙葉品種在五峰縣推廣。煙草空莖病因感染后莖干中空腐爛而得名[2]。伴隨著五峰縣馬里蘭煙種植面積的擴大，空莖病成為制約五峰縣煙葉發展的一種主要病害[3]，為此，于2011年開始對其危害情況進行調查，開展病原菌鑒定、生物學特性研究。

1 材料和方法

1.1 供試材料

分離病株分別采自于湖北省五峰縣付家堰鄉火山村、大龍坪村煙田，選取具有典型癥狀的煙葉和莖干。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化 切取新鮮病葉、病莖病健交界處組織， 經75%乙醇和0.1%氯化汞溶液表面消毒， 無菌水沖洗后加無菌水研磨制成懸浮液， 采用平板劃線法分離[4]。分離培養采用結晶紫果膠酸鹽（CVP）培養基[5]。將劃線后的培養皿置于28 ℃培養箱， 2 d后出現杯狀凹陷菌落。5 d后選取單個菌落在LB培養基上進行純化培養[4]。

1.2.2 致病性測定 將分離純化的病原菌在LB培養基上活化培養2～3 d，加5～10 mL無菌生理鹽水制成菌懸液。滅菌土中栽培煙葉的幼苗長到5～6片葉時采用注射接種法進行接種，用注射器緩慢地把 1 mL液體LB 培養基菌懸液注入到傷口表面， 形成懸浮滴，以生理鹽水作為空白對照（CK）。培養環境溫度為28 ℃、相對濕度為90%，觀察發病情況。

1.2.3 病原菌的形態鑒定 病原菌在28 ℃培養18～24 h，進行革蘭氏染色，鞭毛染色采用西薩基爾鞭毛染色法[4]，置光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察。

1.2.4 病原菌的生理生化測定 對病菌進行耐鹽性、碳水化合物利用、檸檬酸鹽利用，吲哚試驗和37 ℃下生長試驗等測試，方法參照文獻[6]。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態

分離物在LB培養基上的菌落淡黃色， 圓形或不定形，表面光滑，微凸起，半透明，邊緣整齊。在電鏡下進行觀察（圖1），菌體短桿狀，大小（0.5～1.0）μm×（2.2～3.0） μm，周生鞭毛2～8根，無莢膜，不產生芽孢，革蘭氏染色陰性。在結晶紫果膠酸鹽培養基上產生杯狀凹陷。

2.2 病原菌的致病性測定

接種的10株煙草（其中苗期5株，成株期5株）均先后發病。發病最快的接種后第三天即出現與田間感染病株相同癥狀（圖2）。對照煙苗未見發病。根據柯赫氏法則進行回接試驗，證明所分離病原菌是煙草空莖病致病菌。

2.3 病原菌的部分生物學特性

病原菌生物學特性的生理生化測定結果（表1）顯示，所分離病菌能在5%鹽濃度下生長，能在37 ℃下生長，利用蔗糖發酵產酸，兼性厭氧，也能利用檸檬酸鹽，但不能產生吲哚。這些特性與黃俊斌等[7]所鑒定的魔芋軟腐病病原菌的特性以及東秀珠等[8]對胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）的描述相一致。

3 結論

根據病原菌分離物的菌體形態特征及部分生理生化特性，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和參考文獻[9]描述的特征，可以初步確定導致五峰馬里蘭煙感染空莖病的病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種， Erwinia carotovora subsp. carotovora， Ecc）[10]，與文獻[11]的報道一致。經南京農業大學植物病原分子生物學實驗室對分離物進行16 S rDNA 序列測定及NCBI Blast比對，其序列與Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum菌株相似度為99%，進一步確認五峰馬里蘭煙空莖病的病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種。

參考文獻：

[1] 錢祖坤，文光紅，趙傳良，等.馬里蘭煙新品種五峰1號的選育及特征特性[J].安徽農業科學，2012，40（24）：11972-11973.

[2] 高喬婉.廣東煙草病害圖譜[M].北京：高等教育出版社，1993.

[3] 李錫宏，黎妍妍，許汝冰.湖北省煙草主要病害發生規律及原因淺析[J].湖北植保，2010（5）：15-16.

[4] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[5] 牟晉華，張光明，徐文玲，等.山東省大白菜軟腐病菌種群分布的研究[J].山東農業科學， 2007（5）：84-85.

[6] 臧 威.黑龍江省大白菜軟腐病菌致病力類型分化及抗源篩選的研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2003.

[7] 黃俊斌，邱仁勝，趙純森，等.魔芋軟腐病病原菌的鑒定及生物學特性初步研究[J].華中農業大學學報，1999，18（5）：413-415.

[8] 東秀珠， 蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[9] 任欣正.植物病原細菌的分類和鑒定[M].北京：中國農業出版社，1994.

[10] HAUBEN L，MOORE E R B，VAUTERIN L，et al. Phylogenetic position of phytopathogens within the Enterobacteriaceae[J]. System Application Microbiology，1998，21：384-397.

[11] 甘發林，張宏健，余君山，等.興山縣煙草空莖病的發生原因及防治技術[J].湖北植保，2004（6）：14-15.