老芒麥花粉活力和柱頭可授性及授粉方式研究

摘要：用TTC法測定了老芒麥（Elymus sibiricus L.）花粉的活力，用聯苯胺-過氧化氫法測定了其柱頭的可授性；采用套袋方法，進行自花、異花授粉及開放授粉方式下單穗結實率統計，探討老芒麥的授粉方式。結果表明，盛花期后相應天數的花粉活力是早熟老芒麥>中熟老芒麥>晚熟老芒麥；花粉活力從最高到無，早熟老芒麥可持續6 d，中熟老芒麥和晚熟老芒麥可持續5 d。3種熟性的老芒麥在盛花期開始后的前2 d柱頭可授性強；早熟老芒麥和中熟老芒麥的柱頭從盛花期第一天開始直至第10天均有可授性，晚熟老芒麥的柱頭從盛花期第一天開始至第八天均有可授性，因此老芒麥的最佳授粉期在盛花期第一至二天。老芒麥為自花授粉植物，具有一定的天然雜交率。

關鍵詞：老芒麥（Elymus sibiricus L.）；花粉活力；柱頭可授性；授粉方式

中圖分類號：S543+.9 文獻標識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）18-4469-04

老芒麥（Elymus sibiricus L.）是禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）披堿草屬（Elymus L.）多年生疏叢型中旱生牧草，為披堿草屬模式種，是分布于北半球寒溫帶的一種比較古老的野生草種，富含蛋白質，是牛、馬、羊均喜食的優等飼用禾草，具有適應性強、易栽培等優良特性，是中國北方地區優良的多年生栽培牧草，具有葉量大、品質好等優點，被廣泛用于人工草地建植和天然草地改良[1，2]。目前，在老芒麥的引種育種、栽培利用、抗性、基因組組成和進化關系、種間雜交、遺傳多樣性等方面研究較多[3-12]，而對老芒麥有性生殖過程的研究甚少。在植物有性繁殖過程中，兩性之間的傳粉是基礎，傳粉過程始于花藥開裂和成熟花粉的散出，攜帶著雄配子或其前體的花粉粒，必須在具有活力時到達適宜的接受柱頭才能保證受精過程的順利進行。植物受精成敗受花粉活力、柱頭生活力和環境溫度、濕度等影響。近年來，對花粉活力與壽命及柱頭可授性的研究已經引起了不少學者的重視，開展了大量研究工作[13]，對老芒麥花粉活力、柱頭可授性的研究目前尚未見報道，關于老芒麥的授粉方式至今也未有定論。盤朝邦[14]記載老芒麥為異花授粉植物，閔繼淳[15]也指出老芒麥是異花授粉植物；徐柱[16]記載老芒麥為自花授粉植物；而Hamrick等[17]曾對涉及165個屬449個種的不同類型植物的遺傳變異水平和居群分化程度進行統計，結果發現自花授粉植物51%的變異存在于居群間，異交風媒植物絕大部分（90.1%）的遺傳變異存在于居群內，只有9.9%存在于居群間，鄢家俊等[18]對川西北高原野生老芒麥居群穗部形態多樣性研究表明居群間變異系數為30.69%，從這個結論來看老芒麥既不屬于嚴格意義上的自花授粉植物也不屬于異花授粉植物。本試驗以3個不同熟性老芒麥為材料，對其花粉活力、柱頭可授性及授粉方式進行研究，旨在探索老芒麥的遺傳規律，為揭示老芒麥的生殖特性以及為其雜交育種、豐產栽培提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用老芒麥為種植第四年的老芒麥，按照《老芒麥種質資源描述規范和數據標準》[19]的規定，老芒麥的熟性可分為早熟（<95 d）、中熟（95～115 d）和晚熟（>115 d）3種類型。試驗材料為早熟、中熟和晚熟老芒麥。

1.2 方法

1.2.1 花粉活力測定 盛花期第一天取花序中部小穗的第一、二朵小花，選取穎片展開后露出的尚未開裂花藥，用消毒鑷子取花藥放于有干濾紙的培養皿中，于常溫（23 ℃左右）下保存，每個類型的不同開花日期的花粉放在不同的載玻片上，并標記好類型及開花日期，重復3次。盛花期第一天取下花藥后立即測其活力，花后第二天起每天上午9：00～10：00取花粉用TTC法測定其活力，連續測定直至花粉活力喪失。

TTC法步驟：用干凈鑷子取一個花藥置于載玻片上，加1滴0.5% TTC溶液用鑷子將其充分搗碎，迅速蓋上蓋玻片，將載玻片置入內有濕濾紙的培養皿中，連同培養皿放置在37 ℃黑暗條件下，20～30 min后置Motic BA200 顯微鏡下觀察，統計蓋片中央5 個不重疊視野中紅色花粉所占比例（經TTC法檢測后，有活力的花粉粒被染成紅色，無活力的花粉粒仍為其自身的顏色），10個重復，求其平均值。計算公式為：花粉活力=變紅色的花粉數目/花粉總數目×100%。

1.2.2 聯苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性 盛花期第一天開始，每天標記同時開放花序中部小穗的第一、二朵小花，剪取開花后不同天數花序中部小穗的第一、二朵小花，將其柱頭浸入凹載玻片中含反應液（1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22，體積比）的凹面處，若柱頭具有可授性（呈現出過氧化氫酶活性），則柱頭周圍的反應液呈現藍色并有大量氣泡出現。染色10～20 min后在 Motic 體視顯微鏡（×4）下觀察柱頭染色的部位，將柱頭至少2/3部位呈現藍色并伴有大量氣泡出現算作柱頭有可授性，否則認為沒有可授性。

根據氣泡多少判斷柱頭可授性的相對強弱：①“+++”表示柱頭可授性強，柱頭至少2/3部位呈現藍色并有大量氣泡出現；②“++”表示柱頭可授性較強，柱頭至少2/3部位呈現藍色并有較多氣泡出現，但比“+++”的少；③“+”表示柱頭具有可授性，柱頭可授性弱，氣泡數低于“++”，藍色不太明顯；④“+/-”表示部分柱頭具有可授性；⑤“-”表示柱頭不具有可授性。

1.2.3 結實率統計

1）自交。老芒麥孕穗后，在開花之前，當整穗的1/3抽出超過旗葉時，采用套袋法，對每個居群單株的任意5個穗套袋使其自交，每天晃動紙袋促進花粉散發。

2）異交。同一居群內，株高相近的兩個基因型的植株靠近，每個單株隨機取5個穗套于同一袋中，定時晃動紙袋。

3）開放授粉。自然狀態下的授粉結實。

單穗種子統計：不論大小，以不空癟、具有硬實的穎果為準，統計花序不同部位結實率。結實率以百分比表示。結實率=每一花序結實的小花數/每一花序的小花總數×100%。

1.3 數據分析

用SPSS 13.0進行單因變量雙因素方差分析（Univariate）和Tukey LSD多重比較法分析數據。

2 結果與分析

2.1 不同熟性老芒麥花粉活力比較

3種熟性老芒麥均于2012年4月10日進入返青期，早熟老芒麥于6月16日進入初花期，6月21日進入盛花期第一天，花粉活力最高為37.87%，7月9日完熟；中熟老芒麥于6月30日進入初花期，7月4日進入盛花期第一天，花粉活力最高為33.22%，7月23日完熟；晚熟老芒麥于7月14日進入初花期，7月21日進入盛花期第一天，花粉活力最高為24.13%，8月1日完熟。早熟老芒麥進入盛花期第一天的花粉活力與中熟老芒麥差異不顯著（P>0.05），但均極顯著（P<0.01）高于晚熟老芒麥。早熟老芒麥花粉活力從最高到無持續6 d，中熟老芒麥和晚熟老芒麥則可持續5 d（表1）。

2.2 不同熟性老芒麥柱頭可授性

通過聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭的可授性可知，3種熟性的老芒麥柱頭在盛花期開始后的頭2 d柱頭可授性強。晚熟老芒麥的柱頭從盛花期第一天開始至第八天均有可授性，早熟老芒麥和中熟老芒麥的柱頭從盛花期第一天開始直至第10天均有可授性，強弱略有差異（表2）。

2.3 同一熟性下老芒麥不同授粉方式結實率比較

對同一熟性下老芒麥不同授粉方式結實率進行比較（表3）。結果表明，早熟老芒麥自交結實率高于開放授粉結實率，兩者之間差異不顯著（P>0.05），但均極顯著（P<0.01）高于異交結實率。中熟老芒麥自交結實率略高于開放授粉結實率，兩者之間差異不顯著（P>0.05）；但均顯著（P<0.05）高于異交結實率。晚熟老芒麥3種授粉方式的結實率以開放授粉結實率最高，自交高于異交，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。

3 小結與討論

植物花粉的活力因植物種類及環境條件不同而有很大差異[13]。早熟老芒麥的花粉活力最高為37.87%，晚熟老芒麥的花粉活力最高為24.13%，在自然條件下，不同熟性老芒麥的花粉活力變化范圍較大，這可能是自然條件下影響老芒麥結實格局的主要原因之一。本研究中，試驗材料老芒麥是種植于試驗地第四年的材料，其花粉活力很低，這可能與自然條件下老芒麥的壽命有關。柱頭可授期是花朵成熟過程中的一個重要時期，它能在很大程度上影響自花傳粉率及開花不同階段的傳粉成功率、各種傳粉者的相對重要性、雄性和雌性功能之間的相互干擾、不同基因型花粉之間的競爭以及配子體選擇的機會等[13]。由于柱頭可授性受天數、天氣、雨水等條件的影響，本研究中不同熟性老芒麥柱頭可授性存在差異，早熟、中熟老芒麥柱頭可授期長于晚熟老芒麥，早熟老芒麥第九天柱頭可授性強于中熟老芒麥的，這可能和盛花期開始的時間及當時的環境因素有關。早熟老芒麥盛花期后不同天數的花粉活力高于中熟和晚熟老芒麥；早熟老芒麥花粉活力從最高到無可持續6 d，中熟老芒麥和晚熟老芒麥可持續5 d。3種熟性的老芒麥柱頭在盛花期開始后的頭2 d可授性強。早熟和中熟老芒麥的柱頭從盛花期第一天開始直至第10天均有可授性，晚熟老芒麥的柱頭從盛花期第一天開始至第八天均有可授性。因此，根據老芒麥柱頭最佳可授期和花粉活力可知，老芒麥的最佳授粉期在盛花期第一至第二天。

自交和異交是植物繁育系統研究的一對中心問題[20]。繁育系統通常的定義是代表直接影響后代遺傳組成的所有有性特征[21]，主要包括花綜合特征、花各性器官的壽命、花開放式樣、自交親和程度和交配系統，它們結合傳粉者和傳粉行為是影響生殖后代遺傳組成和適合度的主要因素，其中交配系統是核心[22]。自交主要用于鑒定某對相對性狀的遺傳是否遵循基因的分離定律，同時在雜交育種中，連續自交是獲取能穩定遺傳的純種的主要方法，但是 自交會帶來近交衰退。異交是形成繁育系統中傳粉多樣性的主要動力，異交和自交在種群中的比例部分依賴于自交不親和機制、植物花的結構與發育以及傳粉者的行為[23]。判斷有性生殖成功與否的一個重要標準是結實率的高低[24]，本試驗研究了不同熟性居群內自交、異交的結實率，并與開放授粉的結實率進行了比較。結果表明，早熟老芒麥自交結實率高于開放授粉結實率，但差異不顯著（P>0.05）；兩者均極顯著高于異交結實率（P<0.01）。中熟老芒麥自交結實率略高于開放授粉，兩者之間差異不顯著（P>0.05）；但均顯著（P<0.05）高于異交結實率。晚熟老芒麥3種授粉方式的結實率以開放授粉結實率最高，自交高于異交，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。自交與開放授粉的結實率差異不明顯，但與異交存在顯著差異。因此可以初步判斷老芒麥的授粉方式是自花授粉，有一定的接受外來花粉的能力。

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