黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素的提取工藝研究

摘要：為了更好地利用黃花烏頭（Aconitum coreanum）資源，提高其產(chǎn)品附加值，以黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素的提取量為指標， 通過設(shè)立正交試驗確定影響提取率的主要因素以及最佳提取條件。結(jié)果表明，最佳的熱回流法提取工藝條件為： 提取溶劑為50%乙醇，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶20，提取時間為40min。此提取工藝簡單可行、穩(wěn)定可靠，適用于鹽酸關(guān)附甲素的大規(guī)模提取。

關(guān)鍵詞：黃花烏頭（Aconitum coreanum）；鹽酸關(guān)附甲素； 提取工藝； 高效液相色譜法； 熱回流法； 正交試驗

中圖分類號：Q949.746.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4479-02

黃花烏頭（Aconitum coreanum）[1]，又名關(guān)白附、白附子、竹節(jié)白附、黃烏拉花[2]，為毛茛科烏頭屬植物，為中醫(yī)臨床常用中藥之一。從20世紀末到21世紀初，各國的科學(xué)工作者一直致力于黃花烏頭中活性成分的提取、分離、純化的研究[3]。根據(jù)文獻我們可以了解到，很多現(xiàn)代化的研究方法被應(yīng)用到了黃花烏頭鹽酸關(guān)附甲素的提取中，這些方法的研究讓很多人眼前一亮，看到了成分提取行業(yè)發(fā)展的新方向。同時，這也讓越來越多的人關(guān)注并且加入到這方面的研究中來[4-6]。隨著研究的不斷深入，也暴露出一些原本就存在的問題，例如對外界環(huán)境的污染、成本投入過高等實際問題。由于方法本身的問題、局限性以及現(xiàn)階段科學(xué)技術(shù)水平的限制，使得這些方法在短時間內(nèi)無法應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，不能轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟效益。而傳統(tǒng)意義上的提取方法似乎并未受到人們的關(guān)注，很少有這方面的研究成果報道。加熱回流提取法相對于其他的提取方法具有成本低、污染小、可控性強、提取率穩(wěn)定等優(yōu)點，又是生產(chǎn)中常采用的方法。本試驗采用了傳統(tǒng)的加熱回流提取法對黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素的提取條件進行研究，采用藥典中規(guī)定的高效液相色譜法[7]對其含量進行測定，而不是采取以往的分光光度法，并通過單因素試驗和正交試驗尋找影響提取率的主要因素和最佳條件，希望能夠為實際生產(chǎn)提供一些理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

黃花烏頭干根，2011年9月采于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院藥用植物園。

1.2 試驗儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A型紫外檢測器（島津公司）；HH-S4型恒溫水浴鍋（購于金壇市醫(yī)療儀器廠）；LG-08A型裝高速中藥粉碎機（400g）（購于深圳市百源堂醫(yī)療器械有限公司）；XL-204型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.3 藥品與試劑

鹽酸關(guān)附甲素對照品，購于江西本草天工科技有限責任公司；其他試劑均為分析純。

1.4 鹽酸關(guān)附甲素的提取

將新鮮的黃花烏頭用清水洗凈，陰干，粉碎，過60目篩，備用。精確稱取10.0 g黃花烏頭粉末，用20 mL氨水潤濕30 min，然后將粉末倒入磨口錐形瓶中，加入乙醇，置于水浴中回流提取。提取完成后將錐形瓶取出，放置冷卻至室溫，然后過濾，得到濾液。濾液抽濾，減壓濃縮，再加入HCl酸化，過濾，濾液加50 mL石油醚脫脂，加氨水堿化，調(diào)節(jié)pH至9～10，加入100 mL氯仿，萃取，取氯仿層至25 mL容量瓶中，干燥，用甲醇定容至刻度，搖勻，備用。

1.5 試驗設(shè)計

設(shè)計了4因素3水平正交試驗，考察了提取溫度（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）以及提取時間（D）對黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素提取的影響作用并得出最佳工藝條件。

1.6 鹽酸關(guān)附甲素的測定方法

采用高效液相色譜法測定鹽酸關(guān)附甲素含量，色譜條件為：色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為1%甲酸-乙腈溶液，流速為1 mL/min；檢測波長為205 nm；柱溫30 ℃；檢測時間25 min；進樣量20 μL。

鹽酸關(guān)附甲素提取率=鹽酸關(guān)附甲素濃度×25/藥粉干重×1 000‰

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品溶液的制備及標準曲線的制作

精密稱取鹽酸關(guān)附甲素對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成含鹽酸關(guān)附甲素1 000 μg/mL的標準儲備液。

吸取標準儲備液2.5、5.0、10.0 mL分別置于3個10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成鹽酸關(guān)附甲素濃度分別為250、500、1 000 μg/mL的標準溶液。

用高效液相色譜儀對3個不同濃度的標準溶液進行測定。然后以鹽酸關(guān)附甲素標準濃度為縱坐標，以峰面積為橫坐標，制作標準曲線并得到線性回歸方程。鹽酸關(guān)附甲素進樣量在250～1 000 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性，方程為y=2 177.509x+1 673 485，r=0.989 2。

2.2 精密度試驗

用配置好的鹽酸關(guān)附甲素標準樣品，重復(fù)測試5次，并計算其峰面積的相對標準偏差（RSD）。結(jié)果經(jīng)過測定，鹽酸關(guān)附甲素峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.24%，表明高效液相色譜儀精密度良好，可以進行相關(guān)試驗的測定。

2.3 重復(fù)性試驗

取同一批次黃花烏頭用相同條件提取5份，對其鹽酸關(guān)附甲素含量進行測定，并計算其峰面積的相對標準偏差（RSD）。結(jié)果提取5份黃花烏頭鹽酸關(guān)附甲素，其峰面積的相對標準偏差（RSD）為1.28%，表明試驗具有很好的重復(fù)性。

2.4 數(shù)據(jù)分析

由表2可知，各個因素對黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素提取的影響順序為A>B>D>C，即，提取溫度>料液比> 提取時間>乙醇濃度。最佳搭配為A2B2D2C1，最優(yōu)的提取條件為A2B2C1D2，即，提取溫度為80 ℃、料液比為1∶20、乙醇濃度50%、提取時間40 min。

3 小結(jié)與討論

本試驗采用傳統(tǒng)的熱回流提取法并利用高效液相色譜法對黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素提取工藝進行了研究，得出結(jié)論：提取溫度為80 ℃、料液比為1∶20、乙醇濃度50%、提取時間40 min為黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素熱回流提取的最佳條件，其中提取溫度對提取率的影響最大，其次是料液比和提取時間，乙醇濃度的影響作用最小。

本試驗采用了傳統(tǒng)的熱回流提取法，與其他提取工藝相比，此方法簡單易行、污染小、成本低，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中。本試驗采用高效液相色譜法進行含量測定，相對于以往的分光光度法更靈敏、準確。相關(guān)文獻大都采用分光光度法測定鹽酸關(guān)附甲素含量，此種方法雖然可行但誤差很大。采用高效液相色譜法測定鹽酸關(guān)附甲素的含量，準確度大大提高，結(jié)果更可信。

參考文獻：

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1979.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編輯委員會.中華本草（上冊）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[3] 李 巖，梁 帥.黃花烏頭莖葉化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，2009，34（10）：1220-1222.

[4] 毛淑杰，李先端，程麗萍，等. 關(guān)白附新工藝最佳技術(shù)參數(shù)優(yōu)選[J].中國中藥雜志，1997，22（10）：595.

[5] 許勇華. 川烏中生物堿的提取及其殺蟲活性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[6] 周 琳.植物生物堿的殺蟲作用及應(yīng)用[J].河南林業(yè)科技，2007，27（1）：32-36.

[7] 馮 鋒，黃 劍，劉靜涵.RP-HPLC法測定不同采收期黃花烏頭中關(guān)附甲素的含量[J].中草藥，1999，30（7）：495-496.