R2工程細(xì)菌纖維素酶酶活影響條件初探

摘要：以3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定纖維素酶活力，研究了不同濃度的表面活性劑（Tween 80）、不同緩沖液、不同pH對R2工程細(xì)菌纖維素酶酶活的影響。結(jié)果表明，在35 ℃、Tween 80濃度為1.6%、醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 4.8的條件下纖維素酶酶活最高， 是對照的1.47倍。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；Tween 80；pH；表面活性劑；緩沖體系

中圖分類號：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4486-03

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，也是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物[1]。纖維素是經(jīng)β-1，4葡萄糖苷鍵連接而成的直鏈高分子，具有很強(qiáng)的結(jié)晶性，糖苷鍵能通過酶的催化作用發(fā)生水解。可以通過纖維素酶系來分解纖維素，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀焕玫腄-葡萄糖，再進(jìn)一步發(fā)酵為酒精，對開發(fā)新能源具有重要的意義[2]。

纖維素酶酶解反應(yīng)過程主要受到溫度和pH[3，4]等多方面因素的影響，同時(shí)表面活性劑可以使高分子聚合物變成復(fù)雜的親水性化合物，使纖維素與纖維素酶有效結(jié)合，從而提高纖維素酶的酶解效率[5-7]。試驗(yàn)將表面活性劑、緩沖液和pH對纖維素酶酶活的影響進(jìn)行了研究，以期得到纖維素酶適宜的酶解條件，更高效地轉(zhuǎn)化和利用纖維素。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

卡那霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、羧甲基纖維素鈉（CMC）、Tween 80、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、苯酚、CuSO4·5H2O、CaCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、葡萄糖均為分析純；R2工程細(xì)菌由重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物實(shí)驗(yàn)室提供[8]。

TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-2450紫外可見光光度計(jì)（優(yōu)尼科儀器有限公司）；C型玻璃儀器氣流烘干器（長城科工貿(mào)有限公司）；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BS110S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DZF-6051真空干燥箱（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 R2工程細(xì)菌纖維素酶的分離純化 將R2工程細(xì)菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液于5 ℃、5 000 r/min離心30 min，收集沉淀，往沉淀中加入10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 4.8），超聲波破碎（功率300 W，間歇5 s，99次）。取一小滴菌液于載玻片上，草酸銨結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下觀察破碎情況，直至無完整細(xì)胞。將完全破碎后的菌液裝入離心管，5 ℃， 3 000 r/min離心15 min，上清液于-20 ℃保存[9，10]。

1.2.2 纖維素酶的鑒定和酶活的測定 CMC培養(yǎng)基鑒定纖維素酶[11]。DNS法測定纖維素酶活[12]。一個酶活力單位（U）定義為45 ℃、pH 4.8的條件下，每分鐘催化CMC水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.2.3 纖維素酶酶活最適緩沖液及pH的確定[12] 用醋酸-醋酸鈉緩沖液和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制1%的CMC溶液。在各試管中加入1.5 mL對應(yīng)的1%的CMC溶液，再加入0.5 mL“1.2.1”中提取的酶液，用2 mL 1%的CMC溶液作對照；40 ℃水浴40 min后立即加入3 mL DNS試劑，沸水浴7 min后加入5 mL去離子水，冷卻后測定吸光度。

1.2.4 纖維素酶最適溫度的測定 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，在不同溫度（15、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃）反應(yīng)30 min，加入3 mL DNS試劑，沸水浴7 min后加入10 mL去離子水，冷卻后測吸光值。

1.2.5 纖維素酶酶活最適Tween 80濃度的確定[13] 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，再加入0.1 mL不同濃度的Tween 80溶液，45 ℃反應(yīng)30 min后加入3 mL DNS試劑，沸水浴7 min后加入10 mL去離子水，冷卻后測定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)羧甲基纖維素酶活力測定方法測定溶液中還原糖（葡萄糖）的含量，并以吸光值為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)r2=0.994 8，可以用于纖維素酶活力的測定。

2.2 不同緩沖液及pH對纖維素酶酶活的影響

從圖2可以看出，隨著pH的升高纖維素酶酶活呈先上升后下降的趨勢，合適的pH在4.0～5.5之間，最適pH為4.8，過酸、過堿的環(huán)境會影響酶和底物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致纖維素酶活性的降低。醋酸-醋酸鈉緩沖液為較適緩沖液。

2.3 溫度對纖維素酶酶活的影響

從圖3可以看出，R2工程細(xì)菌纖維素酶的活性先隨著溫度的升高逐漸增加，當(dāng)達(dá)到35 ℃時(shí)纖維素酶的活力達(dá)最大，而后隨著溫度的升高酶活力下降。故酶活最適溫度選擇35 ℃。

2.4 不同濃度Tween 80對纖維素酶酶活的影響

從圖4可以看出，R2工程細(xì)菌纖維素酶酶活在Tween 80濃度為1.6%時(shí)達(dá)到最大，是對照（無Tween 80和緩沖液體系）的1.47倍。在較低濃度時(shí)，隨著Tween 80濃度的增加纖維素酶酶活增強(qiáng)。Tween 80可以減弱發(fā)酵液的表面張力，纖維素被疏水基團(tuán)包圍，使纖維素高分子聚合物變成復(fù)雜的親水性化合物，從而加強(qiáng)纖維素與纖維素酶的有效結(jié)合，提高纖維素酶的酶解效率。當(dāng)酶活達(dá)到最大值后，隨著Tween 80濃度的增加，可能使纖維素高分子聚合物被更多的表面活性物質(zhì)包被，從而減少了纖維素與纖維素酶的接觸機(jī)會，酶活逐漸降低。

3 小結(jié)

試驗(yàn)以DNS法測定了R2工程細(xì)菌纖維素酶活力，研究了不同溫度、不同濃度表面活性劑Tween 80、不同緩沖液及pH對纖維素酶酶活的影響，結(jié)果表明，在35 ℃ Tween80濃度為1.6%、醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 4.8的條件下纖維素酶酶活最高， 是對照的1.47倍。

表面活性劑能夠使大分子聚合物的復(fù)雜空間立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如纖維素是被疏水基團(tuán)包圍，難溶于水，較高的表面活性使纖維素高分子聚合物變成復(fù)雜的親水性化合物，因此，纖維素酶可以方便地吸附底物，從而表現(xiàn)出酶活的增加。但是隨著表面活性劑Tween 80濃度的不斷增加，會使表面活性劑與纖維素酶之間的電荷積累而相互排斥，也可能因?yàn)楸砻婊钚詣┡c纖維素相互吸附降低了酶與底物的吸附從而使酶活下降。

在當(dāng)今環(huán)境污染嚴(yán)重、能源緊缺的情況下，將纖維素酶反應(yīng)體系擴(kuò)大應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，把纖維素轉(zhuǎn)化生成葡萄糖或酒精，能夠提供重要的工業(yè)原料和能源物質(zhì)，這對開辟新原料、新能源物質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

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