凡納對蝦crustin 2基因的序列及結(jié)構(gòu)分析

摘要：以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）crustin 2基因?yàn)檠芯繉ο螅ㄟ^基因克隆、氨基酸序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析以及分子結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測。結(jié)果表明，crustin 2基因可能在凡納對蝦的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的抗菌功能，是一個(gè)重要的免疫效應(yīng)基因。

關(guān)鍵詞：凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）；crustin 2基因；克隆；分析

中圖分類號：S917.4；Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4526-03

凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）具有良好的抗菌、抗病毒等遺傳特性。其先天免疫系統(tǒng)一直是研究熱點(diǎn)，科研工作者試圖通過研究抗菌、抗病毒相關(guān)的基因來發(fā)現(xiàn)凡納對蝦優(yōu)良性狀的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。本研究以凡納對蝦crustin 2基因?yàn)檠芯繉ο螅寺×嗽摶虻腸DNA序列，并對基因序列的同源性、分子進(jìn)化上的親緣關(guān)系、初級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納對蝦購自于包頭市友誼水產(chǎn)市場，并于超凈工作臺(tái)中剖取凡納對蝦肝胰腺、鰓等組織，用于提取總RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 參照說明書，利用TRizol總RNA提取試劑盒提取凡納對蝦的肝胰腺和鰓等組織的總RNA[2]，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑誧DNA第一鏈合成試劑盒的操作說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增 以提取的凡納對蝦的總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]。利用前引物F和反轉(zhuǎn)錄使用的后引物3′ anchor R引物配對，來擴(kuò)增目的基因的ORF的3′端序列；同時(shí)利用后引物R和反轉(zhuǎn)錄使用的前引物5′ PCR primer引物來擴(kuò)增目的基因ORF的5′端序列，通過已有的中心片段以及兩端片段拼接來獲得基因的完整cDNA序列。

1.2.3 重組載體的構(gòu)建與序列測定 使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將目的基因回收、純化之后，參照T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒使用說明書，將目的基因片段克隆到T載體中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選后，進(jìn)行序列測定[4]。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 氨基酸序列比對 將凡納對蝦crustin 2基因的cDNA序列進(jìn)行比對。用Expasy在線軟件對crustin 2基因進(jìn)行翻譯，預(yù)測蛋白質(zhì)序列信號肽和結(jié)構(gòu)域；氨基酸序列比對利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN完成[5]。

1.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制 根據(jù)凡納對蝦crustin 2基因序列比對的結(jié)果，選擇物種相近的生物的crustin 2基因，利用分子生物學(xué)軟件MEGA 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制[6]。

1.3.3 分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測 根據(jù)Expasy在線軟件對凡納對蝦crustin 2基因序列進(jìn)行翻譯的結(jié)果，利用SMART網(wǎng)站中蛋白質(zhì)分子初級結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆和序列分析

以凡納對蝦各組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，利用特異性引物F和R以及反轉(zhuǎn)錄過程中使用的引物5′ PCR primer和3′ anchor R擴(kuò)增凡納對蝦crustin 2基因cDNA序列。結(jié)果（圖1）表明，凡納對蝦crustin 2基因cDNA序列的ORF長度為456 bp，編碼151個(gè)氨基酸；并且在ORF的下游2 bp處存在一個(gè)加尾信號AATAA序列。在氨基酸序列中，N端的18個(gè)氨基酸組成了信號肽序列，靠近C端的49個(gè)氨基酸形成了一個(gè)經(jīng)典的WAP結(jié)構(gòu)域，其中包括了8個(gè)保守存在的半胱氨酸。在信號肽序列與WAP結(jié)構(gòu)域序列之間，存在著富含甘氨酸的基序以及保守存在的另外4個(gè)半胱氨酸。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

將克隆得到的凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）cDNA序列，進(jìn)行基因序列BLAST比對，選擇了cDNA序列同源性較高的5種相近物種的crustin基因，進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對分析。結(jié)果表明，巴西美對蝦（Farfantepenaeus brasiliensis）crustin基因（Fbr-crustin）、小褐美對蝦（Farfantepenaeus subtilis）crustin基因（Fsu-crustin）、南美藍(lán)對蝦（Penaeus stylirostris）crustin基因（Pst-crustin）、大西洋白對蝦（Litopenaeus setiferus）crustin基因（Lse-crustin）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）crustin基因（Pmo-crustin）均與凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）氨基酸序列上具有較高的同源性。氨基酸N端的信號肽序列的相似性較高，C端都存在著一個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域。信號肽序列與WAP結(jié)構(gòu)域之間的富含甘氨酸的基序（Gly-rich motif）以及保守存在的另外4個(gè)半胱氨酸相似程度特別高。

2.3 凡納對蝦crustin 2與其他對蝦crustin的親緣關(guān)系分析

對凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）序列進(jìn)行BLAST比對之后，利用分子生物學(xué)軟件MEGA 4.0進(jìn)行相近物種的crustin系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析與繪制。結(jié)果（圖2）表明，凡納對蝦crustin 2與南美藍(lán)對蝦crustin（Pst-crustin）、大西洋白對蝦crustin（Lse-crustin）分布在進(jìn)化樹的同一支上，說明親緣關(guān)系較近，也表現(xiàn)出了較高的氨基酸序列相似性。

2.4 凡納對蝦crustin 2的結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具SMART網(wǎng)站，對凡納對蝦crustin 2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步預(yù)測。凡納對蝦crustin 2屬于典型的crustin類抗菌肽，存在經(jīng)典的WAP結(jié)構(gòu)域和信號肽序列，WAP結(jié)構(gòu)域和信號肽序列之間存在另外4個(gè)保守的半胱氨酸以及一段富含甘氨酸殘基的結(jié)構(gòu)基序。推測凡納對蝦crustin 2應(yīng)該具有抗菌活性。

3 小結(jié)與討論

以凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）為研究對象，克隆了凡納對蝦crustin 2基因的cDNA序列，進(jìn)行了氨基酸序列的比對分析以及通過繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹來分析各個(gè)對蝦crustin與凡納對蝦crustin-2之間的親緣關(guān)系情況，初步預(yù)測了分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，凡納對蝦crustin 2屬于典型的甲殼肽抗菌肽，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)符合甲殼肽的結(jié)構(gòu)特征，存在WAP結(jié)構(gòu)域和富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)基序，推測凡納對蝦crustin 2應(yīng)該具有抗菌活性，在凡納對蝦的先天免疫系統(tǒng)中可能發(fā)揮著重要的抗菌功能，為下一步基因功能的研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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