5種不同顏色葉片的紅楓SRAP標記

摘 要：為確定5種不同顏色葉片的紅楓的遺傳范圍，以紅楓葉片DNA為模板，通過SRAP-PCR擴增體系優化，對88個引物組合篩選后進行19對引物的SRAP標記。研究結果表明，5種紅楓DNA可被15對引物區分，擴增出特異性條帶，其基因組有差異。

關鍵詞：紅楓；葉片；SRAP；分子標記

中圖分類號 S792.99 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）12-13-04

紅楓為槭樹科槭樹屬雞爪槭的園藝變種，以其優美的樹姿、別致的葉形、豐富的季相而著稱，是南方園林中廣泛應用的紅色葉樹種。在生產實踐中，筆者發現了紫色、深紅色、鮮紅色、黃色和葉片紅葉脈黃5種不同顏色的紅楓。

序列擴增相關多態性是由Li和Quiros在2001年提出的一種新型分子標記[1]，該標記利用1對引物對基因組DNA進行擴增，又叫一步PCR法。它具有操作簡便、高度共顯性、遍布整個基因組、便于克隆測序目標片斷等特點。本研究用SRAP對紅楓5種不同顏色葉片的DNA進行標記，標記其基因組差異性。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗于2012年5～7月進行，供試材料分別為紅楓S16紫色葉片、S27深紅色葉片、S39鮮紅色葉片、S24黃色葉片和S3花葉（葉片紅色，葉脈黃色）5種。取當年生嫩葉，用保溫桶帶回實驗室，提取DNA，-20℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與分離 按改良的CTAB的方法[2]提取基因組DNA，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質量。稀釋至所需濃度后，-20℃保存。

1.2.2 SRAP標記 引物選擇參考Lin等[3]、Ferriol[4]等和Riaz[5]等的方法。所選引物序列如表1所示。

正向引物和反向引物由上海生工公司合成。根據合成引物的Tm值，確立合適的退火溫度。建立特異引物PCR擴增的反應體系，進行PCR擴增，前5個循環為94℃變性1min，35℃復性1min，72℃延伸1.5min，后30個循環僅將復性溫度升為50℃。最后72℃延伸8min。最后，篩選出12對特異性引物對5種紅楓DNA進行標記。

2 結果與分析

2.2 擴增條件優化結果 參照何正文等[6]和汪結明等[7]的正交設計直觀分析方法，按表3設計的16個處理進行PCR反應，進行正交試驗后，將所得到的產物進行電泳，結果如圖2。

從圖2中可以看出，第5種體系條帶較清晰，最終的正交優化結果如下：

在25μL反應體系的PCR薄壁管中依次加入：

ddH2O，17.85μL；10×PCRbuffer，1.6μL；正向引物（10μmol/L），0.45μL；反向引物（10μmol/L），0.45μL；MgCl2（2.5mmol/L），1.6μL；dNTPs（0.2mmol/L），0.75μL；Taq聚合酶（5U/μL），0.3μL；模板DNA（50ng），2μL。

2.3 引物篩選 采取上述優化體系，以編號為S3的DNA作為模板，共篩選了88對引物組合。

由圖3、4、5可以看出，在相同的擴增條件下，不同引物擴增結果明顯不同，呈現多態性，在條帶的位置和條帶的亮度、寬度、多少等方面都存在一定的差異。

擴增結果如圖3、4、5，篩選出清晰、明亮、多態性好的引物組合為me1me8，me1em10，me1em11，me2em4，me2em9，me3em6，me4em10，me5em1，me5em5，me5em10，me7em2，me7em4，me7em5，me7em6，me7em7，me7em9，me8em3，me8em5，me8em8。

2.4 SRAP標記 挑選上述19對引物對紅楓5種DNA分別進行擴增，DNA中出現差異性條帶，如圖6所示。

從圖6中可以看出，19對引物中，共擴增出了59條帶，特異性條帶為24條。引物me2em4，me2em9，me4em10，me7em2，me7em7，me8em5無特異性條帶，其余15對引物均能區分5種DNA，結果如表4所示。

3 結論與討論

3.1 結論 本實驗中，篩選的19對引物對紅楓DNA標記結果表明，me1me8，me1em10，me1em11，me3em6，me5em1，me5em5，me5em10，me7em2，me7em4，me7em5，me7em6，me7em9，me8em3，me8em5，me8em8共15對引物能區分5種DNA，說明這5種紅楓葉片顏色的不同是基因組上的差異。

3.2 討論

3.2.1 關于SRAP引物的篩選 篩選多個引物構建指紋圖譜可以使生物型之間條帶組合差異足夠大，可確保鑒別結果更準確可靠。這樣構建的指紋圖譜即使需要鑒定的生物型不在圖譜范圍內，也不容易錯判。

篩選的引物需要符合2個要求：（1）引物多態性好。多態性好的引物擴增結果可得到大量條帶，信息量豐富。這樣能較好地看出親本之間差異性，有利于遺傳研究。（2）引物擴增的條帶間距大。條帶間距大，各條帶分子量容易確定，可確保生物型鑒定不容易出錯。

3.2.2 關于SRAP-PCR分子標記 SRAP反應涉及的因素多，每一個因素都有可能影響整個SRAP的穩定性和重復性，本研究中對SRAP反應進行了優化篩選，并在標記中做了重復，結果基本穩定一致，說明SRAP標記的穩定性較好。

本研究的實驗操作中出現了一些問題，試驗中得出的解決途徑如下：（1）不同的研究材料、試驗儀器和藥品需要摸索其合適的最佳反應條件；（2）試驗操作一定要規范，嚴格保持反應條件、反應程序、試驗儀器和藥品的一致性；（3）加樣要準確，SRAP反應中由于各組分的用量很少，即使精密的微量移液管，也很難保證其加樣準確一致。在試驗中可以采用混合加樣，將除模板DNA以外的各組分先混合，充分混勻后分別加入薄壁管中，后再加入模板DNA，這樣可以最大限度地保證反應管中各組分濃度的一致性；（4）電泳緩沖液要經常更換，一般電泳時泡沫明顯增多時應及時更換緩沖液，否則條帶容易產生拖尾現象。

總之，只要認真優化反應體系，試驗操作規范，盡可能保持試驗條件和各反應因子的一致性，就能得到良好的擴增效果。

參考文獻

[1]Li G，Quiros C F.Sequence-related amplifid polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassia[J].Theor Ape Genel，2001，103：455-461.

[2]王關林，方宏筠.植物基因工程[M].第二版.北京：科學出版社，2002：533-535.

[3]Lin ZX，Zhang XL，Nie YC.Evaluation of application of a new molecular marker SRAP on analysis of F2 segregation opulation and genetic diversity in cotton [J].Acta Genet Sinica，2004，31（6）：622-626.

[4]Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theor Appl Genet，2003，107：271-282.

[5]Riaz A，Potter D，Stephen M.Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers[J].J Amer Soc Hort Sci，2004，129：204-211.

[6]何正文，劉運生，陳立華，等.正交設計直觀分析法優化條件PCR[J]. 湖南醫科大學學報，1998，23（4）：403-404.

[7]汪結明，項艷，吳大強，等.楊樹ISSR反應體系的建立及正交設計優化[J]. 核農學報，2007，21（5）：470-473.

（責編：徐世紅）