石油—重金屬復合污染土壤的微生物修復

摘要：以鹽堿土為供試土壤，分別加入5個濃度的重金屬Cd2+（2.5，5，10，15，20 mg/kg）或Ni（25，50，100，150，200 mg/kg），分別添加2 000 mg/kg石油烴，將加入石油降解菌的試驗組與不加菌的對照組進行對比，研究石油-重金屬復合污染土壤微生物修復過程中重金屬有效態和形態的變化規律。結果表明，石油-重金屬復合污染鹽堿土的微生物修復過程中，土壤中有效態Cd2+、Ni隨培養時間增長，有效態含量呈起伏變化，且土壤中有效態Cd2+與Ni的變化規律存在明顯不同。培養60 d后，土壤中Cd2+的可氧化態含量均下降，可還原態含量均略有增加，低濃度時弱酸提取態Cd2+含量降低，殘渣態Cd2+含量增加，高濃度時變化趨勢相反。培養60 d后，Ni的弱酸提取態、可還原態、可氧化態3種形態總量呈下降趨勢，殘渣態Ni含量則增加，Ni的形態分布由不穩定向穩定方向遷移，活性降低。

關鍵詞：重金屬有效態；形態分布；微生物修復；復合污染；鹽堿土

中圖分類號：X53 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2767-04

Microbial Remediation of Petroleum-Heavy Metals Contaminated Soil

CHEN Xue-lan，CHENG Jie-min，GAO Xian-wen，YANG Lu

（College of Population， Resources and Environment， Shandong Normal University， Jinan 250014， China.）

Abstract： The contaminated saline-alkali soil was prepared by adding appropriate concentrations of CdCl2（2.5，5，10，15，20 mg/kg） and NiCl2（25，50，100，150，200 mg/kg） firstly. After the metal-treated soil was incubated for two months， 2 000 mg/kg of petroleum was added. Test group of adding petroleum degrading sgtains and test group without such strains were compared， the change pattern of availability and form of heavy metals during microbial rernediation process in petroleum-heavy metals comtarminated soil. The results indicated that the availability of soil Cd and Ni both had a tendency of alternately fluctuanting change with the elapsing of time. But， their change law was proved significantly different. The content of oxidizable Cd decreased while the content of reducible Cd increased after 60 days of cultivation. At low concentrations of soil Cd2+， the content of acetic acid extractable Cd decreased while the content of residual Cd increased. However， it showed a contrary tendency at high concentrations of Cd2+. The total amount of the acetic acid extractable， oxidizable and reducible Ni all decreased while the content of residual Ni increased after cultivation for 60 days. As a result， the form distribution of Ni tended from the stable to the unstable state with the reduction of active Ni.

Key words： availabiliy of heavy metals； species distribution； microbial remediation； composite pollution； saline-alkali soil

長期以來，環境工作者僅限于單一污染物在自然環境中的遷移轉化、歸趨及生態效應的研究[1]。隨著工業的快速發展和科學技術的不斷創新，人們逐漸認識到環境污染物多具有伴生性和綜合性[2，3]，即不同污染物之間會產生聯合作用，形成復合污染。國外研究結果表明，石油中可檢測出Ni、V、Fe等56種微量金屬元素，石油勘探和開采、原油泄漏等原因會導致大量重金屬進入土壤環境，土壤石油污染可能會伴生土壤重金屬污染[4-6]。Chukwujindu[7]研究發現，在尼日利亞尼日爾河三角洲石油污染土壤上可檢測到大量重金屬Zn、Cu、Pb、Cd、Ni、Cr、Mn。邵濤等[8]對江蘇某油區已開采多年的未耕土壤研究表明石油污染土壤中總As、Pb、Cr等都有不同程度的污染。因此，油田區石油-重金屬復合污染土壤的研究及修復，已成為亟待解決的問題。

由于成本低、易操作、作用持久等，微生物修復石油污染土壤已成為研究和應用熱點[9-12]。眾所周知，石油烴在土壤中的代謝中間產物是很復雜的，而現有的文獻報道，有機物對重金屬環境行為的影響十分復雜，高分子有機物通過絡合或螯合、吸附、截留等作用， 鈍化土壤中重金屬；低分子有機物通過螯合、絡合作用活化土壤中重金屬，重金屬以不同形態存在關系到在石油-重金屬復合污染土壤修復過程中微生物的降解效率以及是否需要增加輔助工程解決重金屬污染等問題，因此石油-重金屬復合污染土壤修復過程中就必須考慮重金屬有效態及形態的變化。針對石油-重金屬復合污染土壤修復過程中可能產生的次生污染問題展開研究，通過培養試驗研究了石油-重金屬復合污染土壤微生物修復過程中重金屬Cd、Ni的有效態和形態變化，為復合污染土壤的修復提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與供試材料

供試土壤采自山東省東營市孤島油區的鹽堿土，主要采集0～20 cm的表層土壤，經風干磨細過20目篩備用，土壤基本理化性質見表1。土壤基本理化性質按常規方法測定[13]。

添加石油烴為原油，含水率為60%。

供試微生物由山東省科學院提供的耐鹽堿并可降解石油的枯草芽孢桿菌和多食鞘氨醇桿菌。

1.2 研究方法

稱取0.5 kg過20目篩風干土樣于塑料盆中，選取Cd、Ni兩種重金屬，分別配置含Cd濃度為 0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/kg和 Ni 濃度為0、25、50、100、150、200 mg/kg的模擬污染土，在室內培養兩個月后，備用。因需考慮土著微生物對石油降解和重金屬行為變化的影響，每個處理再設加菌與不加菌對照。將石油烴溶解后加入土壤并充分混合，使石油烴濃度達到2 000 mg/kg，每缽施氮、磷、鉀作基肥，試驗組同時施加40 g/kg濃度的石油降解菌劑。保持土壤含水率在50%～70%范圍內[14]，以60 d為周期，每隔15 d采樣測定重金屬有效態的含量，并在起始及結束時測定土壤重金屬形態，分析重金屬形態變化特征。

1.3 分析方法

土壤中Cd、Ni有效態分析：DTPA（pH 7.3，液土比2∶1）浸提，原子吸收分光光度法測定重金屬含量[15]。

土壤中Cd、Ni形態分析：采用歐洲共同體標準物質局提出的BCR法[16]，弱酸提取態用0.11 mol/L的醋酸提取；可還原態用0.1 mol/L的鹽酸羥胺（HNO3酸化，pH 2）提取；可氧化態用8.8 mol/L的雙氧水（HNO3酸化，pH 2）水浴氧化，然后用1 mol/L的醋酸銨（HNO3酸化，pH 2）提取；殘渣態用10 mL HF+1 mL HClO4消煮，方法同全量測定[13]。

2 結果與分析

2.1 土壤中重金屬有效態含量變化

由表2可知，不論加降解菌與否，土壤中有效態Cd含量隨培養時間呈跌宕起伏變化，各處理組沒有呈現明顯的規律性，但幾乎所有的處理組均在培養60 d時，土壤有效態Cd含量達到最大值。這可能一是土壤中Cd對微生物新陳代謝產生影響的同時，微生物也能夠通過產生胞外聚合物、代謝產生有機酸等改變土壤中Cd的生物有效性；二是微生物菌體對重金屬有一定的吸收作用。這種跌宕起伏的曲線，可能和土壤中微生物生長曲線有一定的關系，此外，這里所研究的土壤為石油-重金屬復合污染鹽堿土，隨著培養時間的增加，微生物對石油降解率增加，石油降解的中間產物可能會對重金屬有一定的鰲合作用，也影響著土壤中Cd的生物有效性[17，18]。

從表2還可以看出，幾乎所有添加降解菌的處理各培養時間土壤中有效態Cd含量均低于相應不加降解菌的處理。可以進一步說明微生物對土壤中重金屬有一定的固持作用。當添加Cd濃度為20 mg/kg時，培養45 d后，添加降解菌的處理土壤中有效態Cd含量高于相應不加降解菌的處理，原因可能是微生物在高重金屬濃度下失去活性。

由表3可知，不論加降解菌與否，土壤中重金屬有效態Ni含量均隨時間有較大的起伏。土壤中Ni的添加量50、100、200 mg/kg處理組在培養的前15 d隨著培養時間的延長土壤中有效態Ni含量呈現增加的趨勢；隨后土壤中有效態Ni含量明顯降低，至30 d時達到較低水平；在45 d時土壤中有效態Ni含量略微增加或穩定不變；隨后，土壤中有效態Ni濃度明顯下降，在培養60 d時達到最低水平；當土壤中Ni的添加量在≤25 mg/kg時，土壤中有效態Ni的含量沒有呈現明顯的規律性。

值得注意的是，除添加Ni濃度≤25 mg/kg的土樣外，其余處理各培養時間土壤中有效態Ni含量添加降解菌的均高于相應不加降解菌。看來微生物對土壤中Cd和Ni形態的影響機理不同，相關影響機理有待進一步研究。

2.2 土壤中重金屬形態分布變化

圖1描述了加菌與不加菌培養60 d后重金屬Cd形態的變化。經過60 d培養試驗后，不同處理土壤中Cd形態分布發生了明顯的變化。但添加菌與不添加菌處理對土壤中Cd形態分布的影響沒有明顯差異。不論添加菌與否，土壤中Cd的可氧化態含量均下降，可還原態含量均略有增加。當土壤中Cd的添加量低于5.0 mg/kg時，與未培養土壤相比，無論添加菌與否，培養60 d土壤Cd的弱酸提取態含量普遍呈下降趨勢，殘渣態含量均呈上升趨勢；當土壤中Cd的添加量為5.0 mg/kg時，與未培養土壤相比，無論加菌與否，培養60 d土壤Cd的弱酸提取態含量和殘渣態含量均增加；當土壤中Cd的添加量高于10.0 mg/kg時，與未培養土壤相比，無論添加菌與否，培養60 d土壤Cd的弱酸提取態含量均增加，殘渣態含量普遍下降。土壤重金屬形態與重金屬在土壤中的遷移性、可給性、活性及污染土壤修復有密切關系。弱酸提取態重金屬與土壤結合較弱，最易被釋放，有較大的可移動性[19]；Fe/Mn氧化物結合態即可還原態在還原條件下易溶解釋放[20]；有機物及硫化物結合態即可氧化態在氧化環境下易溶解釋放；殘渣態屬于不溶態重金屬，它只有通過化學反應轉化成可溶態物質才對生物產生影響[19]。因此，應該尤其重視高濃度Cd和石油復合污染土壤的研究，防止因Cd的活化而造成的二次污染問題。

不論添加菌與否，培養60 d后土壤中Ni形態分布均發生了顯著變化（圖2）。土壤中Ni可氧化態含量均下降，各處理組中其余形態分布并未呈現明顯的規律性。與Cd不同的是，添加降解菌對土壤Ni形態分布產生了顯著影響。添加降解菌的土壤中Ni的弱酸提取態含量均減少，且低于相應不添加菌的處理；殘渣態含量均升高，且普遍高于相應不加菌的處理（未添加Ni處理除外）。降解菌的添加對土壤Ni可還原態和可氧化態含量的影響沒有明顯的規律性。值得注意的是，石油-重金屬復合污染土壤微生物修復過程中，Ni的弱酸提取態、可還原態、可氧化態3種形態總量呈下降趨勢，Ni的形態分布由不穩定向穩定方向遷移，降低了重金屬 Ni的活性。這與DTPA提取態Ni含量在培養60 d時達到最低水平是相符的。

3 結論

1）在石油-重金屬復合污染土壤微生物修復過程中，土壤中有效態Cd和Ni含量均隨培養時間呈跌宕起伏變化，但土壤中有效態Cd與Ni的變化規律存在明顯不同。另外，除個別土樣外，絕大多數添加降解菌的處理各培養時間土壤中有效態Cd含量均低于相應不加降解菌的處理；Ni的變化正好與此相反。

2）在微生物修復石油-重金屬復合污染土壤過程中，重金屬Cd、Ni的存在形態均發生了顯著變化。但加菌與不加菌處理對土壤中Cd形態分布的影響沒有明顯差異，說明土著微生物與外源降解菌對Cd形態分布影響機理相差不大。在添加外源Ni的處理中，添加降解菌的土壤中Ni的弱酸提取態含量均減少，且低于相應不加菌的處理；殘渣態含量均升高，且普遍高于相應不加菌的處理。降解菌的添加對土壤Ni可還原態和可氧化態含量的影響沒有明顯的規律性。

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