5—aza—dc對延邊奶山羊耳成纖維細胞生物學特性的影響

摘要：通過DNA甲基轉移酶抑制劑5-aza-dc對延邊奶山羊耳成纖維細胞進行不同處理后，利用MTT比色法選定5-aza-dc的最適作用濃度和時間，用Hochest33342/PI雙染和瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡情況，通過核型分析檢測5-aza-dc對細胞染色體的影響。結果表明，低濃度的5-aza-dc（≤0.010 μmol/L）作用72 h對細胞影響不大；隨其濃度的增加，細胞形態、活率、凋亡及染色體都受到顯著影響。5-aza-dc對細胞的最佳處理時間為72 h，此時低濃度的5-aza-dc并未引起細胞凋亡和核型改變。

關鍵詞：5-aza-dc；延邊奶山羊；細胞活率；細胞形態；細胞凋亡

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2862-04

Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell

CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，FNAG Nan-zhu，LI Zhong-shu

（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.

Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis

體細胞核移植是哺乳動物胚胎工程的主要組成部分，也一直是研究的熱點。然而核移植研究中仍然存在著許多問題，如核移植效率低、胚胎發育異常、流產、畸形等。大量研究表明，體細胞核移植所用的供體細胞（成纖維細胞、顆粒細胞等）都是高度分化的細胞，具有較高的甲基化水平，在與受體細胞融合時需要經過去甲基化才能維持胚胎正常發育，如果重構胚基因組DNA的甲基化模式存在異常，可引起特定基因轉錄模式發生改變，從而導致重構胚發育異常。因此，有必要尋找一種降低DNA甲基化水平，進而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，為正常胞嘧啶核苷的類似物。在細胞內這種核苷類似物可以轉化為脫氧核苷三磷酸，并在DNA復制的過程中替代正常的胞嘧啶核苷酸參與到延伸的DNA鏈中，一旦進入DNA雙鏈后，它們所含有的修飾堿基——5-氮胞嘧啶可以與DNA甲基轉移酶共價結合，使酶的活性降低，最終使處理細胞基因組DNA發生去甲基化；有研究表明DNA甲基轉移酶抑制劑5-aza-dc處理牛供體細胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金輝[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）處理水牛成纖維細胞，顯著降低了供體細胞的甲基化水平并提高了隨后核移植的效率。延邊奶山羊耳成纖維細胞作為延邊奶山羊體細胞克隆的核供體有重要的研究意義。因此，本研究旨在探討5-aza-dc對延邊奶山羊體細胞克隆供體細胞的影響，為提高延邊奶山羊體細胞克隆效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO預融，超純水配制成0.25 mg/mL的濃縮液備用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基礎藥類均購自SIGMA中國有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取試劑盒購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 材料 延邊奶山羊耳部組織塊。剪取奶山羊（母）耳部血管較少處組織，大約1.5×2.0 cm2。用PBS沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS沖洗3次，最后將組織塊剪碎。經過3～5次PBS及胰蛋白酶洗滌后，均勻接種于25 cm2培養瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培養液[4]。每3～5 d換液1次。當原代細胞匯合至80%時，消化傳代，3代以后的成纖維細胞可用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細胞 取3代以上的延邊奶山羊耳成纖維細胞，消化傳代，調整細胞密度為105個/mL，接種于24孔或96孔培養板，待細胞處于對數生長期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培養液分別培養。5-aza-dc的濃度設定為0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。

1.2.2 5-aza-dc對細胞活率的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各處理成纖維細胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培養液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯反應儀測492 nm處的OD值。

1.2.3 5-aza-dc對細胞形態的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 5-aza-dc對細胞染色體的影響 不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，換液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化懸浮細胞，1 000 r/min 離心10 min，37 ℃預溫的0.075 mol/L KCl低滲處理30 min后，用新鮮固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定細胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液懸浮細胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油鏡觀察[5]。每組處理選取一定數量的清晰分裂相，記錄變異的染色體數目。

1.2.5 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

1）Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，消化懸浮細胞，調整細胞密度為106個/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342熒光染色，37 ℃避光孵育10 min，離心去上清，用培養液懸浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察[6]。

2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測細胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，消化收集細胞于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，500 μL PBS懸浮細胞后，按DNA提取試劑盒步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 數據分析

試驗所得數據使用SPSS17.0進行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法處理數據。

2 結果與分析

2.1 5-aza-dc對細胞活率的影響

由表1可知，不同濃度的5-aza-dc分別培養延邊奶山羊耳成纖維細胞24、48、72、96 h后的細胞活率，比較可知72 h組效果較好，且與48 h、96 h組差異不顯著，因此后續試驗中細胞均處理72 h。

2.2 5-aza-dc對細胞形態的影響

由圖1可知，未經5-aza-dc處理的細胞生長狀態良好，接觸緊密，細胞大小均一，生長速度較快。而經過5-aza-dc處理后的細胞隨著5-aza-dc濃度的升高，細胞變得細長，生長緩慢，細胞間隙增大，形態不規則，甚至有的地方細胞大片脫壁死亡。

2.3 5-aza-dc對細胞染色體的影響

采用常規核型分析方法，分析不同濃度的5-aza-dc處理的延邊奶山羊耳成纖維細胞，每個處理組選取50個分散較好的清晰分裂相，統計畸變染色體概率。由圖2可知，當濃度≤0.010 μmol/L時，染色體畸變率對照組與其他兩組差異不顯著；當濃度≥0.030 μmol/L時染色體畸變率顯著增加，出現多倍體（圖3）。當濃度達到0.1 μmol/L時，染色體畸變率達到12%。

2.4 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細胞凋亡 Hochest33342/PI雙染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞呈強藍色、弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色，而正常的細胞則呈弱藍色熒光。當濃度為0、0.005、0.010 μmol/L時，凋亡細胞較少；濃度≥0.030 μmol/L時出現較多凋亡細胞；濃度為0.100 μmol/L時，細胞凋亡增加，死細胞數目也增多。如圖4所示。

2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測細胞凋亡 由圖5可知，當濃度≤0.010 μmol/L時，細胞無拖帶現象，說明無凋亡細胞；濃度≥0.030 μmol/L時開始出現拖帶現象，說明出現凋亡細胞；濃度為0.050、0.100 μmol/L時，細胞大量凋亡，拖帶現象明顯。

3 討論

3.1 5-aza-dc對細胞活率、細胞形態的影響

5-aza-dc是一種典型的DNA甲基轉移酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc處理第五代豬胎兒成纖維細胞（PFF），發現不同濃度的5-aza-dc均抑制PFF的生長，較高濃度的5-aza-dc處理會導致細胞的形態和染色體的倍性發生改變。Enright等[8]對供體成纖維細胞進行5-aza-dc處理后發現高劑量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低細胞甲基化水平，其研究也發現5-aza-dc處理72 h為最佳處理時間。鑒于5-aza-dc對細胞的毒性作用，本試驗采用較低濃度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）處理延邊奶山羊耳成纖維細胞。結果表明，經5-aza-dc處理后的細胞生長速度、形態等與對照組相比無明顯差異，說明延邊奶山羊耳成纖維細胞對5-aza-dc具有較強的耐受性。但是隨著處理時間的延長，細胞形態改變、死亡數增多，逐漸出現脫壁等現象，這可能是與5-aza-dc對細胞的毒性有關。這與Kumar等[7]的試驗結果一致。

3.2 5-aza-dc對細胞染色體的影響

有研究證明，供體細胞的培養環境以及藥物等處理會導致其染色體異常，進而引起隨后NT胚胎染色體異常，說明在核移植前首先檢查供體細胞的染色體還是必要的[9]。本試驗使用常規染色體核型分析方法，即經低滲、固定、Giemsa染色等步驟后，滴片制備染色體標本。結果表明，高濃度的5-aza-dc對細胞染色體有致畸作用，濃度越高染色體出現異常的幾率越大；而低濃度（≤0.010 μmol/L）對染色體影響不大。通過瓊脂糖凝膠電泳實驗進一步驗證高濃度的5-aza-dc對染色體的影響，可見明顯的拖帶現象，分析原因可能是染色體結構發生改變，如斷裂等。

3.3 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

PI、Hochest33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hochest33342則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。本研究用5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細胞72 h后，觀察不同的濃度對細胞凋亡的影響，采用Hochest33342和PI雙染色法檢測細胞凋亡，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞呈強藍色、弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色，而正常的細胞則呈弱藍色熒光。正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hochest33342著色，但是正常細胞核的Hochest33342著色的形態呈圓形，淡藍色，內有較深的藍色顆粒；而凋亡細胞的核由于濃集而呈亮藍色，或核呈分葉，碎片狀。細胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內源性核酸酶的激活，細胞核染色體從核小體間斷裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。針對這些片段應用瓊脂糖凝膠電泳技術。凋亡細胞呈明顯的梯狀條帶。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳結果可見，0～0.010 μmol/L幾組都沒有出現明顯的拖帶現象，而從0.030 μmol/L組就開始有拖帶現象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L濃度組與對照組相比細胞發生凋亡的比例顯著增加。此結果進一步證明高濃度的5-aza-dc可以導致細胞凋亡。

5-aza-dc處理延邊奶山羊成纖維細胞適宜時間為72 h，隨著5-aza-dc處理濃度的升高，細胞形態有所改變，接觸不緊密。當濃度升高到0.100 μmol/L時大片細胞脫壁死亡；當濃度≥0.030 μmol/L時，染色體畸變率顯著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L組對染色體核型的影響與對照組相比差異不顯著；瓊脂糖凝膠電泳法檢測經5-aza-dc處理的細胞凋亡情況，結果表明高濃度的5-aza-dc可以導致細胞凋亡，低濃度的5-aza-dc對細胞凋亡的影響較小。以上說明高濃度的5-aza-dc對細胞有一定毒性作用，但是低濃度對細胞影響較小，可以應用低濃度的5-aza-dc作為DNA甲基轉移酶抑制劑處理供體成纖維細胞，嘗試建立一種既不影響成纖維細胞生物學特性，又可以降低供體細胞核的甲基化狀態的方法，從而提供一種提高體細胞核移植效率的方法。

參考文獻：

[1] 李世杰.體細胞克隆中核的重編程[J].科學通報，2004，49（8）：721-726.

[2] 馬康目.細胞核重編程對克隆的影響[J].生命科學，2008，20（3）：431-437.

[3] 舒金輝.水牛體細胞核移植與甲基化檢測的研究 [D].南寧：廣西大學，2007.

[4] 于昊贏.不同冷凍程序和冷凍保護劑對延邊奶山羊耳部成纖維細胞冷凍效果的影響 [D].吉林延吉：延邊大學，2012.

[5] 孫曉冬.延邊奶山羊耳成纖維細胞培養體系的建立 [D]. 吉林延吉：延邊大學，2012.

[6] 李鳳珍. 5-氮-2′-脫氧胞苷對牛成纖維細胞周期、染色體和凋亡的影響 [D].武漢：華中農業大學，2009.

[7] KUMAR B M，JIN H F，KIM H J，et al.DNA methylation leves in porcine fetal fibroblasts indueed by an inhibitor of methylation 5-aza-dc[J].Cell Tissue Res，2006，325（3）：445-454.

[8] ENRIGHT B P，KUBOTA C，YANG X，et al.Epigenetic characteristics and development of embryos cloned from donor cells treated by triehostatin A or 5-aza-2′-deoxycytidine [J]. Biol Reprod，2003，69（3）：896-901.

[9] KANG Y K，KOO D B，PARK J S，et al. Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos [J]. Nature Genetics，2001（28）：173-177.