高效液相色譜法同時測定動物飼料中的4種雌激素

摘要：采用反相高效液相色譜法同時測定動物飼料中的4種雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）。檢測條件為色譜柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，檢測波長279 nm，柱溫25 ℃。結果表明，4種雌激素成分在0.02～200 μg/mL濃度范圍內與其對應峰面積呈良好線性關系。樣品平均加標回收率為92.4%～109.3%，RSD為2.4%～3.4%，飼料中4種雌激素的檢出限為0.010～0.030 mg/kg。該法操作簡便、靈敏度高，可同時檢測動物飼料中4種雌激素含量。

關鍵詞：高效液相色譜法；雌激素；動物飼料

中圖分類號：O657.72 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2907-02

Determination of Four Estrogens in Animal Feeds by HPLC

YU Xiao1，ZHAI Hai-yun1，LIN Hai-dan2，ZHAO Chun-hua1，LU Qi-wen1，PAN Yu-fang1

（1. Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006，China；

2. Guangdong Institute of Veterinary Drug and Feedstuffs Control， Guangzhou 510230，China）

Abstract： The simultaneous determination method of four estrogen （estrone， estriol， ethiny， diethylstilbestrol） in animal feeds were established by RP-HPLC with Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm） column at 25 ℃. The mobile phase consisted of methanol-water （60∶40，V/V）. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 279 nm. The results revealed that there were good linear responses in the range of 0.02～200 μg/mL of 4 estrogens， and LODs were 0.010～0.030 mg/kg. The average recoveries were 92.4%～109.3% with RSD of 2.4%～3.4%. Consequently， the method was simple， sensitive for quality control of these estrogens in animal feeds.

Key words： HPLC； estrogen； animal feeds

飼料安全是動物性食品安全的重要環節，近年來，由飼料安全問題引發的食品安全事件時有發生。在飼料和動物飲用水中非法添加的雌激素能促進機體的代謝、生長、發育和繁殖。雌激素在動物體內一般難以降解，人食用后可在人體內（主要是內臟、血液中）積累，擾亂內源雌激素的正常作用，誘發癌癥、早熟、女性男性化和男性女性化等癥狀，其毒性還可通過母體胎盤和母乳傳給后代，對人類健康危害極大[1]。我國農業部176號文件明確禁止在動物飼料和飲用水中添加雌激素。目前激素分析技術主要包括氣相色譜-質譜聯用法[2]、高效液相色譜法[3，4]、液相色譜-質譜聯用法[5，6]等。本試驗建立了高效液相色譜同時測定動物飼料中4種雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）的方法，該方法將為動物飼料中上述4種雌激素的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售雞、豬、蝦、魚配合飼料。

1.2 試劑與儀器

色譜純甲醇，購于Dima公司；去離子水；其余試劑均為分析純。雌三醇對照品（批號100935-200701）、炔雌醇對照品（批號100052-200308）、雌酮對照品（批號100849-200501）、己烯雌酚對照品（批號100033-200607）均購于中國藥品生物制品檢定所。

高效液相色譜儀（LC-10ATvp型輸液泵，SCL-10Avp型控制器，二極管陣列檢測器，LC Solution色譜工作站，日本島津）、超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、離心機（鞏義市予華儀器有限公司）、數控恒溫水浴鍋（北京康林科技有限責任公司）、電子分析天平、0.45 μm微孔濾膜及配套注射器。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（60∶40，V/V），流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：279 nm，進樣量：20 μL。樣品測定采用色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，外標法峰面積定量。

1.3.2 對照品和供試品溶液的制備 分別稱取雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚對照品各1 mg，用甲醇溶解并定容至1 mL，配成質量濃度為1 mg/mL的標準溶液。分別移取適量上述標準溶液到5 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成濃度為0.02～200 μg/mL的混合標準溶液。稱取飼料樣品1.000 g于10 mL離心管中，加入9 mL甲醇，超聲波處理60 min，離心，移取上層清液至另一支10 mL離心管，氮氣吹干；加入4 mL甲醇，超聲波溶解5 min后轉至5 mL離心管，并用1 mL甲醇洗滌原離心管，合并于5 mL離心管中，氮氣吹干；加1 mL甲醇超聲波溶解殘渣5 min，溶液經 0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件

在上述色譜條件下4種對照品的色譜圖見圖1。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關系及檢出限 在設定色譜條件下，標準工作液的濃度為0.02～200 μg/mL，分別取20 μL進行HPLC分析。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明4種雌激素均在0.02～200 μg/mL范圍內波度與峰面積線性關系良好，相關系數大于0.999 9，各標準品的線性回歸方程和檢出限（s/n=3）如表1所示。

2.2.2 精密度試驗 用濃度為10 μg/mL的混合標準溶液重復進樣6次，分別測定4種雌激素的峰面積，并計算出相對標準偏差為2.1%～3.3%。

2.2.3 加標回收率試驗 準確稱取不同種類的不含雌激素的飼料樣品1.000 g，平行6份，分別添加適量混合標準溶液，充分混勻后按照“1.3.2”制備供試品溶液，按色譜條件測定，結果見表2。雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚的平均加標回收率分別為92.4%～99.3%、102.8%～109.3%、90.5%～95.7%和100.6%～107.8%，平均RSD分別為3.0%、2.7%、2.4和3.4%。

2.3 樣品分析

按本方法對市售動物飼料樣品進行測定，色譜圖見圖2。以保留時間和檢出峰的光譜圖定性分析，外標法定量。結果表明，雞、豬、蝦和魚配合飼料中均檢出含有雌三醇，含量分別為1.11、1.87、0.919和3.13 mg/kg，但未檢出雌酮、炔雌醇和己烯雌酚。另外，從圖2可見，樣品經前處理后，各飼料基質對雌激素的檢出無干擾。

3 小結

在預試驗中比較了不同配比甲醇-水、乙腈-水流動相體系對各雌激素分離以及飼料基質干擾的影響，結果表明，在60∶40體積比的甲醇-水流動相條件下，4種雌激素分離良好，飼料中基質成分不干擾測定。采用二極管陣列紫外檢測器對物質進行檢測，可通過保留時間和檢出峰的光譜圖進行雌激素的定性分析，避免了普通紫外檢測器的假陽性結果。由于本試驗所用的幾種動物飼料中均檢出雌三醇，故提示相關部門應加強相關食用動物飼料中相關雌激素的管理和監督。

參考文獻：

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[2] 曾東平，林翠萍，曾振靈，等. 氣相色譜-質譜法檢測豬肌肉中8種性激素的殘留[J]. 動物毒物學，2008，41（9）：2776-2782.

[3] 劉紅菊，閆 沖，劉宏果. 反相高效液相色譜法同時測定飼料中的10種性激素[J].中國飼料，2010（18）：34-36.

[4] 張建勛，田 穎，李雪蘭，等. 高效液相色譜法測定飼料中雌二醇含量的方法研究[J].飼料工業，2005，26（13）：47-48.

[5] 叢培福，柯潤輝，程勁松.超高壓液相色譜一串聯質譜法測定乳制品中性激素類興奮劑多殘留的研究[J].食品安全質量檢測學報，2010，27（1）：36-42.

[6] 張 毅，藍 芳，張 峰，等. 液相色譜-串聯質譜法測定谷物類飼料中的41種激素[J].色譜，2011，29（6）：523-534.