兩種葉綠素提取方法的比較

摘要：以5種植物葉片為試驗材料，采用分光光度法研究了4種提取溶劑及兩種提取方法對植物葉片葉綠素提取量的影響。結果表明，兩種提取方法中，丙酮與乙醇的混合溶劑提取整體上好于丙酮、乙醇單獨提取的效果；浸提法中，浸提時間為18 h和24 h效果較好，且浸提時間的增加降低了提取溶劑的影響。生產上采用混合溶劑提取時，浸提18 h是較為理想的選擇。

關鍵詞：葉綠素；提取方法；比較分析

中圖分類號：Q244；TS202.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5303-02

Comparative Analysis of Two Extraction Methods of Chlorophyll

XU Xin-juan，LI Yong-chao，ZHANG Shang-pan，SHEN Qi，ZHANG Zhen-guo

（Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： With five plant leaves as the experimental material， the effects of four extraction solvents and two extraction methods on chlorophyll content were studied by spectrophotometry. The results showed that the extraction efficiencies of chlorophyll using mixed solvent were better than using acetone or ethanol alone. The results were better with the extraction time 18 h and 24 h， respectively， and the effect of extraction solvent was reduced with increasing extraction time. In production， extraction time of 18 h is an ideal choice with mixed solvent as extraction solvent.

Key words： chlorophyll； extraction methods； comparative analysis

植物葉片葉綠素含量與光合作用關系密切，葉綠素含量的測定無論是在生理上還是在選育品種以及抗性研究等方面都很有必要性。分光光度法是測定葉綠素含量的經典方法，傳統的葉綠素提取方法為研磨法，即植物材料經過研磨、過濾或離心、定容后再進行比色測定，整個過程繁瑣且誤差較大，操作中還易受光氧化的破壞，不適于對田間大量樣品的測定和大量葉綠素的提取，也不適合大批量樣本的應急檢測。隨后提出的浸提法采用溶劑浸泡葉片的方法將葉綠素萃取出來，然后進行比色測定。直接浸提植物葉樣并測定葉綠素提取量，免除了傳統提取中研磨、離心過濾等繁瑣手續，方法簡單易行、效率高，且減少了誤差來源，穩定性好。王元軍[1]研究指出，研磨法提取黑豆芽菜葉綠素的效果好于浸提法，但很多植物上的應用結果顯示浸提法比研磨法提取葉綠素效率更高且穩定性好[2-4]。但浸提法受多種提取試劑的影響，并且浸提時間的長短也影響最終的測定結果。因此，本研究以5種植物葉片為試驗材料，采用4種不同的溶劑分別用研磨法和浸提法提取葉綠素，測定葉綠素提取量，研究浸提溶劑及浸提時間對葉綠素提取量的影響，并對浸提法和研磨法兩種提取葉綠素的方法進行比較，以期為植物葉綠素的提取和測定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為玉米、大豆、棉花、三葉草、爬山虎的葉片，均取自河南科技學院試驗田。丙酮、95%乙醇及無水乙醇均為分析純試劑。

1.2 方法

提取溶劑設80%丙酮、95%乙醇、混合溶劑Ⅰ（V丙酮∶V無水乙醇=1∶1）、混合溶劑Ⅱ（V丙酮∶V無水乙醇=2∶1）。選擇正常生長的新鮮健全植物葉片，用紗布擦凈表明污物，避開主脈進行取樣。剪碎后稱取約0.20 g，一組用不同溶劑研磨并定容至25 mL，過濾后分別測定提取液在663 nm和645 nm處的吸光度；另一組用不同溶劑直接浸提，浸提時間為6、12、18和24 h，然后測定浸提液在663 nm和645 nm處的吸光度。每次測定3次重復。采用Arnon公式計算葉綠素含量：

葉綠素a含量（Chla，mg/g）=

（12.7×A663 nm-2.69×A645 nm）×V/1 000×W

葉綠素b含量（Chlb，mg/g）=

（22.9×A645 nm-4.68×A663 nm）×V/1 000×W

葉綠素總含量（Chla+Chlb，mg/g）=

（8.02×A663 nm+20.21×A645 nm）×V/1 000×W

式中，A663 nm、A645 nm分別為相應波長下葉綠素提取液的吸光度，V為提取液體積，W為葉片鮮重。葉綠素含量單位為mg/g。

1.3 數據分析

所有數據取平均值，采用SAS 9.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 研磨法中提取溶劑對葉綠素提取量的影響

從表1可以看出，研磨法中不同溶劑對植物葉綠素提取量的影響也不同，整體上混合溶劑的提取效果好于單一溶劑。除大豆、三葉草外，其余3種植物用混合溶劑Ⅱ提取的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的提取量最大，且顯著高于80%丙酮和95%乙醇的提取結果（P<0.05）。表明丙酮中加入乙醇增加了溶劑的提取穩定性，這可能是丙酮與乙醇之間存在協同萃取作用[5]。混合溶劑Ⅰ提取的大豆、三葉草葉綠素提取量最大，其中大豆的葉綠素a提取量顯著高于80%丙酮和混合溶劑Ⅱ（P<0.05），可能是植物品種的個體差異所致。

2.2 浸提法中提取溶劑及浸提時間對總葉綠素提取量的影響

從浸提溶劑來看，混合溶劑的提取效果仍顯著高于單一溶劑（表2）。從浸提時間上，浸提6 h時，用混合溶劑提取的總葉綠素提取量均高于單一溶劑的提取結果，其中混合溶劑Ⅱ的提取效果整體最好，80%丙酮的提取效率最低。浸提12 h的結果與6 h基本一致。隨著浸提時間的增加，混合溶劑的提取效率也逐漸提高。浸提18 h時兩種混合溶劑的提取結果沒有顯著差異，24 h后95%乙醇的提取效果與混合溶劑相當，其中三葉草4種溶劑的提取效果沒有顯著差異。這表明在浸提時間短的情況下，浸提溶劑的不同是決定提取效果的關鍵因素，當浸提時間達到一定程度后，溶劑的影響減小，但整體上乙醇的加入改善了提取效果。生產上宜選擇18 h或24 h進行浸提，以獲得最佳的提取效果。

2.3 兩種提取方法提取總葉綠素含量的比較

由表3可知，浸提法4個提取時間的結果與研磨法均無顯著差異，表明浸提法提取葉綠素可以達到傳統研磨法的效果。

3 小結

葉綠素的兩種提取方法中，浸提法雖然在提取結果上與研磨法相當，但提取過程優于傳統的研磨法。丙酮與乙醇混合溶劑的提取效果顯著高于單一溶劑，不同的浸提時間也影響葉綠素的最終提取量。生產上采用浸提法提取植物葉綠素時，混合溶劑的效果較好，提取時間以18 h為佳。在浸提法中除了注意混合溶劑的各成分的比例外，還要考慮提取程度、提取效率以及提取液的穩定性。

參考文獻：

[1] 王元軍.黑豆芽菜葉綠素的提取方法[J].食品研究與開發.2010，31（2）：27-29.

[2] 劉絢霞，董振生，劉創社，等.油菜葉綠素提取方法研究[J].中國農學通報，2004，20（4）：62-63.

[3] 李得孝，郭月霞，員海燕，等.玉米葉綠素含量測定方法研究[J].中國農學通報，2005，21（6）：153-155.

[4] 孫俊寶，王建新.櫻桃葉綠素含量測定方法研究[J].山西農業科學，2010，38（3）：18-19，33.

[5] 洪法水，魏正貴，趙貴文.菠菜葉綠素的浸提和協同萃取反應[J].應用化學，2001，18（7）：532-535.