散發性結直腸癌中CpG島甲基化表型研究及其與微衛星不穩定的關系

[摘要] 目的 研究散發性結直腸癌（SCRC）中CpG島甲基化表型（CIMP）陽性的發生率及其臨床病理特征，并探討其與微衛星不穩定（MSI）的關系。 方法 采用甲基化特異性PCR（MSP）方法對91例散發性結直腸癌患者行P16、hMLH1、MINT1、MINT2和MINT31共5個基因啟動子甲基化檢測，分析散發性結直腸癌中CIMP陽性病例的臨床病理特征。同時應用熒光標記多重PCR法擴增兩個微衛星位點BAT25和BAT26，分析兩個微衛星位點狀況，探討CIMP與MSI的關系。 結果 91例散發性結直腸癌患者中共檢出CIMP陽性者22例，陽性率為24.2%。CIMP陽性者與CIMP陰性者相比，前者好發于近端結腸（P=0.02）、分化程度上低分化癌多見（P=0.03）、組織學類型上黏液腺癌或印戒細胞多見（P=0.04）。27.3%的CIMP陽性病例表現為MSI，54.5%的MSI病例表現為CIMP陽性（P=0.02）。 結論 CIMP的散發性結直腸癌具有好發于近端結腸、低分化癌及黏液腺癌或印戒細胞多見等特點，CIMP與MSI兩者具有密切關系。

[關鍵詞] 散發性結直腸癌；CpG島甲基化表型；微衛星不穩定

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）26-0051-03

近年來研究揭示DNA啟動子異常甲基化是抑癌基因轉錄失活的重要機制，Toyota等[1]提出CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）的概念，用于反映多個抑癌基因的同時異常甲基化狀態。微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）是基因組遺傳不穩定的一個重要標記，在結直腸癌中MSI已成為篩查遺傳性非息肉病性結直腸癌（HNPCC）的重要分子指標[2]，但在散發性結腸癌中，有關CIMP與MSI關系的研究國內外報道尚不一致[3，4]。本研究通過檢測與結直腸癌密切相關的5個抑癌基因的啟動子甲基化狀態，研究散發性結直腸癌中CIMP陽性的發生率及其臨床病理特征，同時探討CIMP與MSI的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集浙江省腫瘤醫院結直腸外科2009年1～6月份收治的手術切除91例結直腸腫瘤標本。所有病例術前均未行放療和化療，并有明確病理診斷，無腫瘤家族史。所有腫瘤標本均于手術切除后15～30 min內取材，并迅速轉移至-80℃低溫冰箱中保存。

1.2 DNA提取

采用酚/氯仿/異戊醇法提取基因組DNA。

1.3 MSP檢測

按文獻方法進行DNA的亞硫酸鹽處理[5]，P16、hMLH1、MINT1、MINT2及MINT31 5個抑癌基因的MSP甲基化及非甲基化引物和反應條件見表1。PCR反應混合物包括：1×PCR buffer[16.6 mmol/L（NH4）2SO4，67 mmol/L Tris（pH 8.8）]，dNTP 0.4 mmol/L，MgCl2終濃度2.5 mmol/L，上下游引物各10 pmol，亞硫酸鹽處理后的模板DNA（30～50 ng），用ddH2O補足體積至25 μL。95℃預反應5 min后加入熱啟動Taq酶（Hot-star Taq DNA多聚酶，Qiagen公司）0.75 U，之后94℃變性45 s，退火溫度45 s，72℃延伸45 s，35個循環，然后72℃延伸7 min，4℃結束反應。以SssⅠ處理過的DNA（New England Biolabs，Ipswich，MA）作為陽性對照，以蒸餾水為空白對照，PCR產物以3%瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外線凝膠掃描系統中觀察結果。MSP產物電泳時只出現未甲基化條帶時為未甲基化，如出現甲基化條帶則為甲基化。5個基因中有2個或2個以上基因同時出現甲基化條帶者，該樣本定義為CIMP陽性[4]。

1.4 MSI檢測

選用BAT25和BAT26兩個位點，PCR反應后將反應物在ABI PRISM 3730XL DNA測序儀上按儀器說明進行毛細管凝膠電泳，數據由GenScan3.1軟件收集后進行分析。如果腫瘤組織DNA出現正常組織DNA沒有的峰形判斷為MSI。本研究按參考文獻將BAT25、BAT26兩個位點均為陰性定義為微衛星穩定（MSS），兩個位點均為陽性定義為高度微衛星不穩定（MSI-H），單個位點陽性者定義為低度微衛星不穩定（MSI-L）[5]。

1.5 統計學分析

采用SPSS13.0軟件分析，比較CIMP陽性者與CIMP陰性者兩者的病理特征，并分析5個基因的甲基化及CIMP狀態與MSI的關系。采用χ2檢驗與Fisher確切概率法進行統計，均為雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

91例SCRC中共檢出CIMP陽性者22例，陽性率為24.2%，5個基因的MSP產物電泳圖及甲基化狀態見圖1及表2。CIMP狀態與臨床病理特征的關系見表3，CIMP陽性者與CIMP陰性者相比，前者好發于近端結腸（P < 0.05）、分化程度上低分化癌多見（P < 0.05）、組織學類型上黏液腺癌或印戒細胞多見（P < 0.05）。27.3%的CIMP陽性病例表現為MSI，54.5%的MSI病例表現為CIMP陽性，5個基因的甲基化狀態及CIMP與MSI的關系見表4，其中hMLH1甲基化及CIMP狀態與MSI密切相關（P < 0.05或P < 0.01）。

3 討論

近年來研究顯示CIMP陽性的SCRC具有獨特的病理特征，Toyota等[1]研究顯示近端結腸癌中82%病例存在CIMP陽性，而遠端結直腸癌只有37%，兩者存在顯著差異。Lee等[6]結果表明CIMP陽性的SCRC多位于近端結腸（24/42），明顯高于CIMP陰性的病例（30/92，P=0.007），本研究結果也顯示CIMP陽性的SCRC多位于近端結腸，與文獻報道一致。本研究還顯示CIMP與腫瘤的分化程度以及病理類型有密切關系，CIMP陽性的SCRC低分化癌更為多見，目前多數文獻顯示CIMP陽性的SCRC與低分化腫瘤有關[6]，但也有研究未發現CIMP狀態與腫瘤分化程度有關[7]，有關CIMP與腫瘤分化程度的機制目前尚不明確。關于CIMP和腫瘤分期的關系，目前文獻報道亦不一致。Shannon等[8]研究發現CIMP陽性的SCRC分期較晚，但也有部分研究未發現CIMP與結直腸癌分期相關[9，10]，本研究中未發現CIMP狀態與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關。

SCRC中CIMP陽性與MSI-H的病例具有相似的臨床病理特征如多位于近端結腸和低分化癌多見等，本研究結果顯示27.3%的CIMP陽性病例表現為MSI，54.5%的MSI病例表現為CIMP陽性，提示CIMP陽性與MSI兩者間存在密切關系，與Lee等[10]的研究結果相似，近年來有研究顯示MSI-H病例的臨床病理特征取決于CIMP狀態[11]。本研究中CIMP 5個基因中hMLH1啟動子異常甲基化與MSI存在顯著關聯，所有hMLH1啟動子異常甲基化的SCRC均表現為MSI。SCRC中較少存在錯配修復基因（MMR）突變，但部分腫瘤存在hMLH1啟動子異常甲基化，提示hMLH1啟動子異常甲基化是SCRC中發生MSI的重要機制。另外有部分MSI-H的SCRC病例表現為CIMP陰性，或者盡管也表現為CIMP陽性，但hMLH1啟動子未檢測到異常甲基化，提示這部分患者的MSI發生還存在其他分子機制[12]，有待進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-06-03）