膽紅素對內毒素致急性肺損傷大鼠水通道蛋白1、5表達的影響

[摘要] 目的 探討膽紅素對脂多糖所致急性肺損傷大鼠的水通道蛋白1、5是否存在調節作用，探討其保護作用機制。 方法 雄性Wistar大鼠18只，隨機分為生理鹽水對照組（C組）、脂多糖模型組（L組）和膽紅素預處理組（B組），每組各6只。每組于造模后4 h處死大鼠。測定每組肺濕/干重比值，ELISA法測血清中IL-8含量，肺組織中cAMP含量，免疫組化法測定每組水通道蛋白1、5的表達變化，觀察各組肺組織病理改變。 結果 與模型組（L組）比較，膽紅素干預組（B組）的W/D值下降，IL-8含量明顯降低，cAMP含量表達上升（P < 0.05），水通道蛋白1、5表達增強（P < 0.05），肺水腫病理改變明顯減輕。 結論 膽紅素可能是通過cAMP信號途徑調節水通道蛋白1、5表達改善水代謝，減輕肺水腫狀態，從而對急性肺損傷具有保護作用。

[關鍵詞] 急性肺損傷；膽紅素；水通道蛋白1；水通道蛋白5；大鼠；肺水腫

[中圖分類號] R965.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0003-04

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全。但近年來人們對急性肺損傷的發病機制仍不十分清楚，尋找有效的防治措施是目前研究的熱點。內毒素所致的急性肺損傷，其主要病理特征為血管通透性增高的肺水腫，表現為肺組織腫脹，組織間隙內大量液體集聚，肺水腫的嚴重程度與急性肺損傷的預后相關，因此改善急性肺損傷所引起的肺水腫具有非常重要的臨床意義[1]。水通道蛋白（AQPs）是一種家族性的膜運輸蛋白，通過脂質雙分子層形成水通道，滲透性地驅動水分子在細胞膜跨越運輸[2]。發生急性肺損傷后AQPs表達會下降，使機體清除過多水腫液的能力下降，導致過多液體在肺泡間質聚積，從而加重肺泡和間質內水腫[3]。由此可見，AQPs 在肺水腫的形成和消除過程中起非常重要的作用。

以往人們認為膽紅素是一種有毒的血紅素終末代謝產物，隨著對其研究的不斷深入，發現膽紅素具有極強的抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡的能力，對急性肺損傷具有一定的保護作用[4]，但其具體作用機制仍不完全清楚，膽紅素對急性肺損傷的保護機制是否與通過調節水通道蛋白（AQPs）有關。我們通過膽紅素干預內毒素誘導的急性肺損傷大鼠，檢測大鼠體內IL-8、cAMP、水通道蛋白1、5的表達，探討膽紅素在急性肺損傷中與水通道蛋白的關系，是否通過cAMP途徑調節水通道蛋白（AQPs），從而完善其具體保護機制。

1 資料與方法

1.1 動物、藥物與主要試劑

雄性Wister大鼠18只，（體重200～250 g）購自中國軍事科學院實驗動物中心，LPS（Sigma公司），膽紅素（英國Frontier scientific公司），IL-8酶聯免疫吸附試劑盒（上海西塘科技公司），cAMP酶聯免疫吸附試劑盒（上海西塘科技公司），AQP-1一抗，AQP-5一抗（美國Abcam公司）。

1.2 模型的制備及分組

雄性Wister大鼠18只，隨機分為三組，適應性飼養1周，分組情況如下：①生理鹽水對照組（C組），尾靜脈注射生理鹽水（2 mL/kg 體重）；②脂多糖模型組（L組），尾靜脈注射LPS（5 mg/kg 體重）；膽紅素預處理組（B組），膽紅素連續灌胃6 d（40 mg/kg 體重），每天上午1次，第6次灌胃后1h尾靜脈注射LPS。每組均于造模后4 h處死大鼠收集標本。

1.3檢測指標與方法

戊巴比妥麻醉固定后，腹主動脈取血5 mL，分離血清保存于-70℃用于測定IL-8。肺濕/干重比，取右肺中葉，稱量濕重量后，置于80℃烤箱，72 h至恒重后測量干重，計算W/D。取右肺上葉肺組織，給予10%甲醛固定，石蠟包埋切片后，進行HE染色，于普通光學顯微鏡下觀察病理組織。取右肺下葉，研磨肺組織勻漿，酶聯免疫吸附試驗測定肺組織中cAMP含量。肺組織免疫組織化學：右肺上葉組織石蠟包埋切片，用SP法檢測AQP-1，AQP-5在肺內的蛋白表達。常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，滅活內源性過氧化物酶，過氧化氫封閉5～10 min，PBS洗3次，每次5 min。高壓抗原修復后，冷卻至室溫。正常山羊血清工作液封閉30 min，滴加AQP-1一抗（抗體濃度1：100），AQP-5一抗（抗體濃度1：200）4℃過夜后，PBS洗3次，每次5 min，AQP-5滴加生物素化羊抗兔IgG，AQP-1滴加生物素羊抗小鼠IgG，室溫，30 min；DAB反應染色，自來水沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。陰性對照以PBS緩沖液作為一抗。染色結果圖像分析以肺組織中出現明確的棕黃色或棕褐色顆粒可判定為陽性結果。每張切片隨機選取5個視野，應用BI-2000醫學圖像分析系統檢測AQP-1，AQP-5的光密度值。

1.4統計學處理

所有計量數據均以（x±s）表示，采用SPSS16.0統計學軟件進行數據分析，均數間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。多個樣本均數間兩兩比較采用LSD-t檢驗，取α=0.05作為檢驗水準，P < 0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1動物的一般情況

C組大鼠精神狀況和反映良好，毛發整齊，抓取會逃避，活動自如。L組大鼠出現呼吸急促，蜷縮成團，毛發豎立，精神萎靡不振，排稀便。B組癥狀與L組癥狀相似，但嚴重程度較之減輕。

2.2 大鼠肺W/D值變化

L組W/D比值明顯高于C組，差異有統計學意義（P <0.05），B組較L組W/D比值降低，但仍高于C組（P < 0.05）。

2.3大鼠肺組織病理學改變

C組無明顯炎癥變化，L組光鏡下可見不同程度的肺泡結構破壞，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔及間質內大量炎性細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡腔內有滲出液，有透明膜形成，局部出現肺不張，肺萎陷。B組肺水腫程度減輕，炎性細胞浸潤減少，肺泡腔無明顯滲出。見圖1。

2.4 血清中IL-8，肺組織中cAMP含量

與C組比較L組IL-8含量明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。B組IL-8含量較LPS組減少，但仍高于C組，其與其他兩組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。L組與C組比較cAMP含量明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05），B組cAMP含量較L組增多，差異有統計學意義（P < 0.05），但仍低于C組（P < 0.05）。見表1。

2.5 AQP-1，AQP-5表達的變化免疫組化結果

正常肺組織中肺泡周圍和支氣管周圍的毛細血管內皮及肺泡上皮均有 AQP-1 陽性染色（棕黃色），LPS組4 h后在毛細血管內皮細胞AQP-1表達明顯下降（P < 0.05），這種減少在全肺均能看到，并非完全局限在損傷嚴重的部位。B組AQP-1表達明顯上調，但與C組之間比較無顯著差異（P > 0.05）。正常肺組織中氣道上皮細胞和I型肺泡上皮細胞也可見AQP-5陽性染色（棕黃色），LPS組4 h后在正常肺組織中氣道上皮細胞和I型肺泡上皮細胞明顯減少（P < 0.05），而且這種減少是均一分布，并不是單純發生在炎癥反應中，上皮細胞脫落多的地方，B組AQP-5表達明顯上升，但與C組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

3討論

急性肺損傷（ALI）是指由心源性以外的各種肺內外致病因素所導致的急性缺氧性呼吸衰竭。在一些病理條件下如：呼吸窘迫綜合癥、充血性心力衰竭，病毒感染等因素刺激時，使肺的水液平衡遭到破壞，肺的液體運輸受到影響，從而導致肺水腫[5]。急性肺損傷（ALI）是以肺水腫為主要特征的一種臨床綜合征，急性肺損傷的病理變化之一就是肺水腫。但目前對肺水腫的發病機制仍不完全清楚，以往人們認為，肺水腫主要是肺泡上皮/微血管內皮屏障功能失調及肺泡液體間隙受損所致，而對存在水通道蛋白（AQPs）調節肺水的轉運、維持肺液平衡的作用卻認識不足。

水通道蛋白（AQPs）是一組與水的通透性有關的細胞膜上的轉運蛋白， AQPs不僅在肺組織中快速控制水的轉運，而且在機體其他組織中也發揮水的新陳代謝的基礎作用。在分子水平上揭示了水跨膜轉運調節的基本機制[6]。肺水腫是以肺泡和肺間質內過多液體積聚為特點。發生時必然伴有液水平衡破壞，水通道蛋白功能的改變，因此充分認識到水通道蛋白對肺臟的作用為臨床治療肺水腫提供重要的依據。

AQPs是一類可調節水進出細胞膜的水通道同源蛋白家族的總稱。在哺乳動物體內目前已被發現的有13種（AQP-0～AQP-12），AQPs在許多組織均有表達，如腎、眼、肺等，分布于肺組織中的AQPs有6種（AQP-1、AQP-3、 AQP-4、AQP-5、AQP-8、AQP-9）[7]。其中AQP-1定位于微血管內皮、支氣管周圍的血管、氣道黏膜上皮和胸膜，肺泡Ⅱ型上皮細胞亦有少量的分布。AQP-5主要發現在肺泡Ⅰ型細胞的頂膜面及氣道分泌腺細胞上[8]。AQP-1、5只負責轉運水，不允許其他溶質和分子通過。AQP-1和AQP-5的作用環節并不完全一致，AQP-1主要負責清除支氣管和脈管周圍的組織的水分，而AQP-5則是清除肺泡腔內的水分[9]。在小鼠肺部遭受病毒感染誘導急性肺損傷引起肺水腫的實驗模型中，觀察到小鼠肺內AQP-1和AQP-5的mRNA和蛋白表達量均有下降，但在肺部炎癥開始減輕后有所恢復[10]。有實驗證明，在肺泡內灌注脂多糖4～12 h后可出現明顯的肺水腫病理變化，AQP-1和AQP-5蛋白表達明顯減少，傷后12 h肺水腫表現開始減輕，同時發現微血管內皮細胞AQP-1的表達量也有部分上升[11]，但AQP-5的含量未見恢復，說明AQP-5蛋白減少的持續時間超過AQP-1，可見AQP-5和AQP-1在結構和功能上存在一定差異。因此可通過提高AQP-1和AQP-5的表達或活性，增加肺水腫患者的肺水清除率，可能是治療肺水腫的一種有效途徑，也為臨床急性肺損傷的治療提供了新的思路[12]。

cAMP-PKA途徑是細胞信號轉導的主要途徑，激動信號與G蛋白偶聯受體結合后導致受體構象改變，由G蛋白偶聯受體（Gi或Gs）將信號首先傳至腺苷酸環化酶（AC），AC可利用ATP生成cAMP，由其控制cAMP的含量，cAMP決定蛋白激酶A（PKA）的活性，蛋白激酶A負責很多蛋白的磷酸化，被磷酸化的靶蛋白往往是調節酶或重要功能蛋白，因而可以介導細胞外信號，調節細胞反應。在水通道的調節中，磷酸化是一個非常重要的過程，AQP-1，AQP-5均含有PKA和PKC的同源序列，且受磷酸化作用直接調節，AQP的磷酸化為cAMP依賴性，在某些刺激因素作用下，腺苷環化酶（AC）被激活，使細胞內cAMP增加，進一步活化PKA或PKC，使其催化AQP上的絲氨酸磷酸化，從而增加細胞膜對水的通透性[13]。cAMP是細胞內的重要信使之一，在跨膜細胞信號轉導中起細胞內信息傳遞作用。在急性肺損傷引起的肺水腫中，可提高cAMP的水平，使其通過信號傳導途徑上調肺泡上皮細胞的鈉水通道及鈉泵功能，提高肺水清除率，增加血管外肺水的吸收[14]。

傳統觀念認為膽紅素是人體內的一種有害代謝產物，臨床上將血中膽紅素含量作為肝、膽、胰疾病嚴重程度的診斷指標之一。但是隨著近年來血紅素加氧酶（HO）/一氧化碳-膽紅素系統研究的不斷深入，發現對膽紅素的認識并不全面。大量實驗研究表明，膽紅素作為一種內源性抗氧化劑，具有極強的抗氧化、廣泛的非特異性抗炎作用及抑制細胞凋亡的能力[15]。在急性肺損傷的發病過程中，膽紅素可發揮抗氧化作用，抑制脂質過氧化物損傷，減少體內抗氧化酶的消耗，減輕內毒素所致的急性肺損傷[16]。膽紅素可以抑制由脂多糖引起的內皮細胞NF-κB從胞漿到胞核的移位，減少相關的炎癥蛋白基因轉錄，幫助中性粒細胞趨化，使局部炎癥介質產生減少，從而減輕肺組織炎癥[17]。同時膽紅素可以對抗氧自由基引發的細胞凋亡的作用，在大鼠急性肺損傷中，caspase-3的表達降低，肺內凋亡細胞數量減少，而caspase-3表達的降低可能是NF-κB的活性受到抑制的結果[18]。膽紅素通過抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等途徑對急性肺損傷起到保護作用。本實驗結果顯示，尾靜脈注射脂多糖引起大鼠急性肺損傷后病理改變為肺泡結構破壞，肺泡腔及間質內大量炎性細胞浸潤，肺間質水腫，W/D比值增加，血清中IL-8含量升高，提示ALI造模成功，肺組織中cAMP含量明顯下降，肺組織中AQP-1，AQP-5表達明顯減少。膽紅素對其預處理后，大鼠肺組織病理損傷程度減輕，W/D，IL-8指標有所下降，但仍高于對照組，cAMP含量上升，AQP-1，AQP-5在肺組織中表達上調。表明膽紅素可能是通過cAMP信號途徑來調節AQP-1，AQP-5的表達。膽紅素通過上調AQP-1，AQP-5的蛋白表達，提高肺水清除率，減輕肺水腫的嚴重程度，從而對急性肺損傷起到一定的保護作用。

肺的水液代謝與水通道蛋白密切相關，但膽紅素對 AQPs 的調節作用未見報道。我們采用內毒素誘發 ALI 大鼠模型，觀察膽紅素對肺水通道蛋白-1（AQP-1）、水通道蛋白-5 （AQP-5）的表達及其病理改變的影響，從而進一步完善膽紅素對急性肺損傷具體保護機制，為膽紅素藥理效應提供新的依據。但其對ALI/ARDS的其他作用和機制還有待于更進一步的研究。

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（收稿日期：2013-02-26）