蜂膠魚油軟膠囊對小鼠免疫功能的影響研究

[摘要] 目的 觀察蜂膠魚油軟膠囊對小鼠免疫功能的影響。 方法 設蜂膠魚油軟膠囊低、中、高3個劑量組（0.17 g/kg、0.33 g/kg、1.00 g/kg，分別相當于人推薦量的5、10、30倍），另設陰性對照組（蒸餾水）和溶劑對照組（大豆油），經口灌胃給藥30 d，觀察對刀豆素A（ConA）誘導脾淋巴細胞增殖功能、綿羊紅細胞誘導的遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）、血清溶血素、抗體生成細胞、巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能、NK細胞活性的影響。 結果 與對照組相比，中、高劑量組能顯著增加小鼠溶血空斑數(shù)，并能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率（P < 0.05）。 結論 蜂膠魚油軟膠囊具有增強非特異和體液免疫功能的作用。

[關鍵詞] 蜂膠魚油軟膠囊；免疫功能；小鼠

[中圖分類號] R151 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0007-03

蜂膠是蜜蜂采集植物的樹脂狀分泌物與蜂蠟，經咀嚼調制而成的一種樹脂狀物質，其成分復雜，而且具有廣泛的生理藥理作用[1]。早在20世紀90年代，龍健飛發(fā)現(xiàn)蜂膠醇提物能夠提高小鼠免疫功能[2]，在2003年日本東京世界蜂膠年會上肯定了蜂膠具有增強免疫的功效[3]，隨后，胡怡秀、譚宗艷、徐德洲、付俊鶴等[4-7]的研究，更加確證了蜂膠無論產地，是否精制，都具有增強免疫力的作用，為開發(fā)蜂膠保健品提供了有力理論支持。針對目前國內多以單純蜂膠制成的保健品為主，在本實驗室前期發(fā)現(xiàn)蜂膠西洋參合劑效果更佳的基礎上，本文參照保健食品檢驗與評價技術規(guī)范[8]，將進一步觀察蜂膠與魚油制成的軟膠囊對小鼠免疫功能的影響，為新型保健品開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂膠魚油軟膠囊，主要由蜂膠和魚油等成分組成，其中蜂膠占30%，魚油占64.8%，內容物為褐色油膏狀，由浙江省中醫(yī)藥研究院提供。試驗前將內容物以大豆油為溶劑配成各劑量，混勻供試。

實驗動物為清潔級ICR雌性小鼠，體重（20±2） g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。生產許可證：SCXK（滬）2007-2005。動物飼料購自浙江省實驗動物中心，執(zhí)行標準GB14924-2001。試驗前小鼠在動物房中適應性常規(guī)喂養(yǎng)3 d。

1.2 方法

1.2.1 分組 實驗開始前隨機分為5組，分別是低、中、高3個劑量組[0.17 g/kg、0.33 g/kg、1.00 g/kg體重，相當于人推薦量的5、10和30倍（人推薦量為每天2.0 g/60 kg）]以及溶劑對照組（大豆油）和陰性對照組（水）。經口灌胃給樣品，灌胃容量按0.1 mL/10 g體重計。

1.2.2 ConA誘導的脾淋巴細胞轉化試驗 各組灌胃給受試物，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第30天，每只小鼠無菌取脾，制成單細胞懸液，用完全培養(yǎng)液RPMI1640調節(jié)細胞濃度至3×106個/mL后分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔，其中一孔加75 mL ConA液，另一孔作對照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，從每孔吸出上清液0.7 mL，然后再加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液以及MTT（5 mg/mL，50 μL/孔）。培養(yǎng)結束后，每孔加入酸性異丙醇1 mL。吹打至紫色結晶完全溶解。之后在570 nm波長處測定光密度值（OD）。淋巴細胞的增殖能力用加ConA的孔的光密度值減去不加ConA的孔的光密度值表示。

1.2.3 綿羊紅細胞（SRBC）誘導的遲發(fā)型變態(tài)反應DTH（足跖厚度法） 灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗的第25 d，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）壓積SRBC懸液 進行免疫。免疫后第4天測量足趾部厚度。之后在每只鼠的測量部位皮下注射20%（v/v）SRBC 20 μL（約1×108個SRBC），注射后24 h測量左后足趾部厚度，同一部位測量3次取平均值。

1.2.4 血清溶血素測定（血凝法） 灌胃給予受試品，每天1次，連續(xù)30 d。在第25天，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）壓積SRBC懸液。5 d后取血，離心收集血清，用生理鹽水倍比稀釋，37℃放置 3 h，觀察血球凝集程度，并計算抗體積數(shù)。

1.2.5 抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法） 各組灌胃給予受試品，每天1次，連續(xù)30 d。在第25天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）壓積的SRBC懸液。5 d后，無菌取脾并制成單細胞懸液，之后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度至5×106個/mL。表層培養(yǎng)基加熱溶解后于45℃水浴保溫，并與等量pH=7.2～7.4、2倍濃度的Hanks液混合后分裝到小試管0.5 mL/管。之后向管內加50 μL 10%的SRBC，20 μL脾細胞懸液，迅速混勻后倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上。待瓊脂凝固后將玻片水平放在片架上，置CO2培養(yǎng)箱中1～1.5 h，然后用生理鹽水稀釋的補體（1∶8）加到玻片架的凹槽內，繼續(xù)溫育1～1.5 h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.6 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗（半體內法） 灌胃給予受試物，每天1次，連續(xù)30 d。每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）壓積的綿羊紅細胞（SRBC）懸液1 mL，30 min后處死。處死后再腹腔注射生理鹽水2 mL。取腹腔液滴片，于38℃溫箱孵育30 min后固定、染色、鏡檢，并計數(shù)100個巨噬細胞，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.2.7 NK細胞活性測定（LDH測定法） 灌胃給予受試物，每天1次，連續(xù)30 d。無菌取脾，制成單細胞懸液并調整細胞濃度至2×107個/mL。試驗前24 h調節(jié)YAC-l細胞（靶細胞）濃度至4×105個/mL。取脾細胞懸液（效應細胞）和靶細胞各100 μL（效靶比50∶1），加到U型96孔培養(yǎng)板中，靶細胞自然釋放孔內加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞最大釋放孔內加靶細胞和2.5% Triton各100 μL。上述各項均設3個復孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。離心后每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質液100 μL，反應7min后每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL，于490 nm波長處測OD值，計算NK細胞活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

各組數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用單因素方差分析比較組間均數(shù)。在總體方差有意義的前提下進行兩兩比較，所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結果

2.1 蜂膠魚油軟膠囊對小鼠體重的影響

連續(xù)經口給藥30 d后，小鼠體重各劑量組未見顯著性差異，結果無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），說明蜂膠魚油軟膠囊不會影響其他營養(yǎng)成分的吸收代謝，也不會造成機體生理功能有損或改變。見表1。

2.2 蜂膠魚油軟膠囊對小鼠胸腺和脾臟臟器系數(shù)的影響

經統(tǒng)計學檢驗，在各劑量組，胸腺和脾臟系數(shù)與對照組相比均無顯著性差異（P > 0.05），表明蜂膠魚油軟膠囊可能不通過促進淋巴細胞的增殖來調節(jié)免疫功能，達到增強免疫力的效果。見表2。

2.3 蜂膠魚油軟膠囊對小鼠細胞免疫的影響

表3顯示，各劑量蜂膠魚油軟膠囊對于細胞免疫影響無顯著差別，結果無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。無論對于蛋白刺激的脾淋巴細胞增殖，還是對于綿羊紅細胞誘導的遲發(fā)型變態(tài)反應，都未見顯著改變。

2.4 蜂膠魚油軟膠囊對小鼠體液免疫的影響

蜂膠魚油軟膠囊在中高劑量組，抗體形成細胞數(shù)發(fā)生顯著性改變，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但是對于血清溶血素水平，各個劑量組與對照組相比，未見統(tǒng)計學差異（P > 0.05），這種改變可能是脾臟中活化B淋巴細胞增多，抗體分泌能力增強，但是組內變異過大，在溶血素水平上未檢出顯著性。見表4。

2.5 蜂膠魚油軟膠囊對小鼠非特異性免疫的影響

研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠魚油軟膠囊在中高劑量下能夠顯著提高巨噬細胞的吞噬功能，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但對于NK細胞的殺傷活性未出現(xiàn)顯著改變（P > 0.05）。見表5。

3 討論

蜂膠魚油軟膠囊主要由蜂膠、魚油等成分組成，現(xiàn)代藥理研究證實，蜂膠所含有的豐富而獨特的生物活性物質，使其具有抗菌、消炎、止癢、抗氧化、增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種功能[9]，對人體有著廣泛的醫(yī)療、保健作用。魚油富含DHA、EPA等多不飽和脂肪酸，能夠保護機體，減少自由基的生成，有研究表明，魚油能夠提高小鼠巨噬細胞吞噬功能，增強細胞免疫[10]。加上蜂膠中有很多成分可以溶于脂類，故本研究將蜂膠和魚油配伍，制成軟膠囊，以期對于提高免疫力有更好的效果，對于開發(fā)新型保健品提高實驗依據(jù)。

本研究結果表明，蜂膠魚油軟膠囊在中高劑量下可明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，同時也能提高抗體形成細胞的數(shù)目，起到增強體液免疫的效果，與以前類似研究[5，6]結論一致，但對于細胞免疫和NK細胞活性，作用不是很明顯，這與以前類似研究[4-7]結果不太一致，推測原因一方面可能是因為蜂膠的制備純度有所差別，蜂膠產地不同，效果也可能不同，另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)，富含n-3不飽和脂肪酸的魚油可能具有免疫抑制作用[11]，這從一定程度上可能抵消蜂膠的增強免疫力作用。當然，由于采用的實驗動物，養(yǎng)殖環(huán)境，地域間氣候對于蜂膠質量的影響等各方面的原因，加上本研究只是基于本次受試物而言，結果也可能出現(xiàn)偏差。但是最終我們仍然發(fā)現(xiàn)蜂膠魚油軟膠囊具有提高免疫力的作用。要深入了解蜂膠魚油軟膠囊的藥理或保健作用，還需要進一步研究。

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（收稿日期：2013-01-30）