不同制片方法對乳腺疾病DNA倍體分析的影響

[摘要] 目的 摸索三種不同制片方法對乳腺疾病石蠟組織細胞的DNA進行定量分析，探討三種方法的優劣及其在細胞DNA定量分析過程中的影響。 方法 本實驗采用常規制片脫蠟法、常規制片脫蠟酶消法、石蠟組織制備細胞懸液法，分別對80例乳腺疾病的石蠟組織進行Feulgen染色，應用全自動DNA倍體分析儀對DNA染色玻片進行掃描分析。 結果 在三種方法中，常規制片脫蠟法染色結果不理想，常規制片脫蠟酶消法取得了最佳的染色效果，而石蠟組織制備細胞懸液法制備的玻片上部分區域存在一定的細胞重疊現象。 結論 常規制片脫蠟酶消法可用于乳腺疾病石蠟切片的DNA倍體分析。

[關鍵詞] DNA倍體分析；乳腺疾?。恢破椒?/p>

[中圖分類號] R44 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0053-03

乳腺癌是危害婦女健康的最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌前病變尤其是非典型性增生與乳腺癌關系相當密切，以組織細胞學形態為主要根據判斷乳腺癌前病變與乳腺原位癌有時相當困難[1-3]。DNA異倍體的形成是一個多因素相互作用的結果，已有很多報道表明，DNA倍體與臨床分期、增殖和預后有關。DNA倍體檢測與分析的技術方法目前在細胞學領域應用廣泛[4-6]，但在乳腺疾病實體組織中的應用國內未見報道。本研究使用三種制片方法對乳腺疾病的石蠟組織進行細胞DNA定量分析，旨在摸索出一種穩定有效的實體組織DNA倍體分析制片方法，為乳腺疾病DNA倍體分析檢測提供前提和必要條件。本文將三種制片方法及其質量等作一比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2012年10～12月送檢乳腺疾病實體組織蠟塊并進行篩選分組，分組如下：乳腺增生癥20例，乳腺非典型增生疾病20例，乳腺原位癌20例，乳腺浸潤性癌蠟塊20例。每例病例選取最具代表性的蠟塊各一塊，共80塊蠟塊。

1.2 制片

分三組對80個蠟塊進行DNA倍體分析前制片工作。

1.2.1 A組（常規制片脫蠟法） 80個蠟塊進行常規石蠟切片，使用切片機行2μm厚切片1張。石蠟切片于56℃烤片15 min，二甲苯脫蠟10min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，蒸餾水清洗后進行。

1.2.2 B組（常規制片脫蠟酶消法） 80個蠟塊進行常規石蠟切片，使用切片機行2μm厚切片1張。石蠟切片于56℃烤片15 min，二甲苯脫蠟，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，蒸餾水清洗，蒸餾水中高壓修復2 min 30 s，37℃胃蛋白酶消化5min，PBS清洗。

1.2.3 C組（石蠟組織制備細胞懸液法） 80個蠟塊進行常規石蠟切片，使用切片機行5 μm厚切片10張。經56℃二甲苯脫蠟20 min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，加入3 mL膠原酶消化液，置37℃恒溫水浴鍋中消化30 min并不斷用吸管吹打，1 000轉/5 min離心沉淀，收集細胞懸液，低滲液低滲15 min，1 000轉/5 min離心沉淀，PBS液漂洗2次，1 000轉/5 min離心沉淀。80例均制備細胞懸液涂片，鏡下觀察確保保留完整的細胞核。

1.3 染色

將A、B、C三組玻片置B.S 固定液中固定50 min；流水洗滌1 min；5N鹽酸酸解1 h，室溫 （25±2）℃；流水洗滌1 min；將切片置Feulgen染液中染色75 min，室溫（25± 2）℃[2]；流水洗滌1 min后，蒸餾水中浸洗15 min[7]。

1.4 脫水

玻片置于75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min。

1.5 封片

將玻片依次置于無水乙醇： 二甲苯（1：1）、100% 二甲苯、100%二甲苯中3 min；再一張張取出，滴加中性樹膠進行封片。

1.6 細胞DNA定量分析

三組所有玻片經Feulgen 染色后采用Motic BA600全自動高分辨率細胞DNA圖像定量分析系統（全自動DNA倍體分析儀）進行掃描分析。系統硬件由全自動數碼顯微鏡Motic600及攝像頭205C組成，對每個標本的單張玻片中約8 000個細胞核進行掃描測定，以標本單張玻片中的正常細胞作為內參，同時進行100多個參數的特征值的處理分析，并根據其不同數值自動完成細胞計數和分類。其中表示DNA含量的DNA指數（DNA Index，DI）為關鍵參數， DI值的計算方法為：被測細胞的積分光密度（IOD）與正常細胞積分光密度的比值。正常上皮細胞DI 值范圍在（1±0.25）之間；當1.25 < DI < 2.5時，可判斷為增生或疑似病變的細胞；病變細胞均為DI≥2.5[8]。該系統會自動識別重疊細胞核及玻片中細胞核碎片等不參與診斷的垃圾細胞（染料殘留也會偶爾出現，也歸于垃圾細胞類），而淋巴細胞和中性粒細胞也會被分析，分類在相應的淋巴細胞組別和粒細胞組別。在臨床工作中由細胞技術員在顯微鏡下對DI≥2.5的所有細胞核進行復核辨別，確保DNA 定量分析檢測的準確。

使用ICLASSY軟件進行圖像分析，觀察A、B、C三組玻片中各個樣本的細胞成像情況、IOD值、MEAN值等指標。被測細胞的積分光密度（IOD）[9]和平均峰值是判定該實驗結果的重要參數，前者決定每個細胞最后的DI值，后者決定標本是否存在標準化偏差。

2 結果

2.1 A組（常規制片脫蠟法）

掃描玻片中細胞數量均達8 000個，鏡下細胞核基本為平層，細胞核完整、少見破裂現象，玻片中有紅細胞、炎細胞存在。部分細胞染色較深，部分細胞染色較淺，IOD值均偏大，在145～165之間，不符合最佳染色深度觀察指標。平均峰值均在1.3以上，不符合最佳染色標準。

2.2 B組（常規制片脫蠟酶消法）

掃描玻片中細胞數量均達8 000個，鏡下細胞結構清晰、背景干凈，細胞核完整，少量紅細胞、炎細胞存在。染色均一， IOD值在120左右，符合最佳染色深度觀察范圍。平均峰值在0.98～1.2之間，符合最佳染色標準。

2.3 C組（石蠟組織制備細胞懸液法）

玻片細胞集中，滴片范圍符合計算機掃片需要，其中3例細胞數量偏少，未達到8 000個細胞。鏡下細胞部分區域有重疊凝集現象，但基本為一層，細胞結構清晰、無紅細胞干擾，有少量炎細胞存在。染色均一，IOD值在110～130之間，符合最佳染色深度觀察范圍。平均值在0.98～1.2之間，符合最佳染色標準。

從上述情況分析，B組質量最好，C組其次，A組較差。

3 討論

早期診斷、早期治療是防治乳腺癌的關鍵，近年來圍繞乳腺癌的各種研究一直很活躍，大量的乳腺疾病文獻指出，單純依靠形態學特征進行診斷存在兩方面的問題[10]：①由于各個病理醫師由于經驗和認識的不同對同一標本存在不同的主觀性，進而得出不同的結論。②經常發現病理分級相同的腫瘤在臨床上出現不同的生物學行為和預后。因此，如何更客觀地反映腫瘤的生物學行為，已成為腫瘤病理學研究的重要課題。腫瘤遺傳學表明，細胞核DNA是細胞的遺傳物質，是決定細胞生長、分化、分裂和各種形狀的重要因素[11]。正常細胞核DNA含量二倍體形式存在， DNA含量變化多為倍性增加，直接反映腫瘤增殖活性的大小。良性腫瘤多以四倍體等形式增殖，而以異倍體增殖多為惡性腫瘤[12，13]。

本文采用全自動細胞DNA倍體分析來判斷預測乳腺疾病進程，是近來研究乳腺癌前病變領域的新手段[14～16]，取得石蠟切片穩定正確的分析結果的基礎是摸索出穩定的石蠟切片進行Feulgen染色制片方法，在整個DNA倍體分析過程中，制片及其染色質量會嚴重影響到報告的診斷質量，對不利因素加以控制，做好質控，對計算機讀取結果正確分析判斷，才能保證結果的準確性。

我們的三組試驗均在同一實驗室同一實驗條件下完成。對三個不同分組的形態學及特征參數進行分別比較。首先進行形態學觀察其細胞核形態是否完整、是否存在多數重疊等現象，其次根據細胞的積分光密度（IOD值）以確定正常二倍體峰的位置。不同組分的細胞IOD值不同，如粒細胞峰的IOD通常會比正常二倍體峰IOD稍低一些，根據這一點，可以判斷正常二倍體峰是否標準化正確。標本操作指南中推薦IOD值在110左右，偏差20%的視為無效玻片，需進行重新掃描或重新制片。再次根據平均峰值，平均峰值通常在0.98～1.02這個范圍，標準化正常的值偏差應該在2%以內，如果標準化的值偏出這個范圍，做分析時就必須要注意。

A組（常規制片脫蠟法）采用常規石蠟制片脫蠟方法制片，經Feulgen染色后進行計算機處理分析，但因未作任何特殊處理，細胞膜上及DNA外包裹蛋白較厚，染料無法滲透均勻，故染色后細胞深淺不均一，計算機掃描處理后數據不佳，IOD值及MEAN值均不在推薦范圍內，造成分析軟件無法進行DNA倍體分析的現象。該組最大的優點是制作簡便，只需在常規制作石蠟切片時多切一張用于DNA倍體分析即可，但鑒于其染色效果不理想，不推薦采用此種制片方法。

B組（常規制片脫蠟酶消法）制片質量最佳。該組也是采用常規石蠟制片脫蠟方法制片，但其進行了高壓修復，高壓修復一般用于甲醛固定石蠟包埋后組織的免疫組化中，加熱使抗原性物質分子運動加劇，使抗原暴露，達到修復的目的[17]。本研究使用高壓修復后經胃蛋白酶消化，可使組織表白中細胞排列密集，特別是出現重疊的細胞經消化后出現更多裸核的效果，但該方法必須嚴格掌握胃蛋白酶的工作濃度和工作時間，否則出現細胞消化過度，細胞出現空泡的現象實驗即宣告失敗。故活檢組織需在消化前在顯微鏡下觀察標本形態以調節消化的時間和濃度，靈活掌握。另不同實驗室組織的消化時間也不會完全一致，應自行摸索消化最佳時間。但該組玻片經Feulgen染色后效果最佳，染色均一，細胞核平層不破裂，紅細胞較少，進行后期DNA倍體分析后得到最穩定可靠的分析數據。

C組（石蠟組織制備細胞懸液法）制作的片子細胞結構清晰，膠原消化液消化黏液，低滲液破壞紅細胞，玻片背景較干凈， 但部分區域有重疊凝集現象，部分腺上皮細胞出現皺縮情況。該組手工滴片穩定性較差，操作步驟較A、B組稍多。因膠原消化液為進口試劑，臨床使用需增加科室制片成本。該組特點是可完全消除紅細胞，樣本上細胞量可根據滴片時的肉眼所見自行掌握，并可反復制作多張玻片。

綜上所述，B組（常規制片脫蠟酶消法）制片方法可用于乳腺疾病石蠟切片的DNA倍體分析，我們進一步的研究將探討從正常乳腺組織到乳腺癌進程中DNA倍體改變情況以及這種改變在腫瘤組織分化中起到的作用，為乳腺癌前病變與乳腺癌發生的臨床診療提供一個新的思路。

4 致謝

感謝科主任和同事們在本文實驗過程中給予的指導，這篇論文的每個實驗細節和每個數據，都離不開同事們的幫助。

[參考文獻]

[1] Cole K，Tabernero M，Anderson KS. Biologic characteristics of premalignant breast disease[J]. Cancer Biomark，2010，9（1-6）：177-192.

[2] Wagner PL，Kitabayashi N，Chen YT. Clonal relationship between closely approximated low-grade ductal and lobular lesions in thebreast： a molecular study of 10 cases[J]. Am J Clin Pathol，2009，132（6）：871-876.

[3] Buerger H，Simon R，Schafer KL，et al. Genetic relation of lobular carcinoma in situ，ductal carcinoma in situ，and associated invasive carcinoma of the breast[J]. Mol Pathol，2000，53：118-121.

[4] Kashyap V. Microphotometric nuclear DNA analysis of atypical squamous cells of the uterine cervix[J]. Indian J Pathol Microbiol，2012， 55（2）：267-268.

[5] Remmerbach TW，Weidenbach H，Pomjanski N，et al. Cytologicand DNA-cytometric early diagnosis of oral cancer[J]. Anal Cell Pathol，2001，22（4）：211-221.

[6] Sorbe B. Predictive and prognostic factors in definition of risk groups in endometrial carcinoma[J]. ISRN Obstet Gynecol，2012：325790.

[7] Kjellstrand P. Mechanisms of the Feulgen acid hydrolysis[J]. J Microsc，1980，119：391-396.

[8] 孟芝蘭，程雪梅，朱晨雁. 全自動DNA 定量分析系統在宮頸癌及癌前病變篩查中的應用價值[J]. 診斷病理學雜志，2012，19（1）：15-17.

[9] 汪薇，王詩航. 光密度值測定在實驗醫學研究中的應用及意義[J]. 解剖科學進展. 2006，12（3）： 286.

[10] Ottesen GL，Christensen IJ，Larsen JK. Flow cytometric DNA analysis of breast cancers with predominance of carcinoma in situ： a comparison of the premalignant and malignant components[J]. Clin Cancer Res，1995，1（8）：881-888.

[11] Barrett MT，Lenkiewicz E，Evers L. Clonal evolution and therapeutic resistance in solid tumors[J]. Front Pharmacol，2013；4：2.

[12] Jacobs KB，Yeager M，Zhou W. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer[J]. Nat Genet，2012，44（6）：651-658.

[13] Ottesen GL，Christensen IJ，Larsen JK. DNA aneuploidy in early breast cancer[J]. Briffsh Journal of Cancer，1995，72：832-839

[14] Ermiah E，Abdalla F，Buhmeida A. Prognostic significance of DNA image cytometry in Libyan breast cancer[J]. Oncology，2012，83（3）：165-176.

[15] Pinto AE，André S，Soares J. Short-term significance of DNA ploidy and cell proliferation in breast carcinoma： a multivariate analysis of prognostic markers in a series of 308 patients[J]. J Clin Pathol，1999，52（8）：604-611.

[16] Ottesen GL. Carcinoma in situ of the female breast. A clinico-pathological，munohistological，and DNA ploidy study[J]. APMIS Suppl，2003，108：66-67.

[17] 王映梅. 高壓抗原修復方法在免疫組化染色的應用比較[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2012，28（10）：1098-1099.

（收稿日期：2013-01-08）