來曲唑通過cAMP—PKA信號(hào)通路影響子宮肌瘤細(xì)胞中MMP—2和TIMP—2的表達(dá)

[摘要] 目的 探討cAMP-PKA信號(hào)通路在來曲唑影響子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2和TIMP-2表達(dá)中的作用。 方法 cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89（10 μmol/L）處理原代培養(yǎng)的人子宮肌瘤細(xì)胞30 min后，來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理24、48和72 h。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 來曲唑以濃度和時(shí)間依賴的方式下調(diào)了人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，上調(diào)了TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)（P均< 0.05）。H-89部分取消了來曲唑誘導(dǎo)的人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的下調(diào)和TIMP-2表達(dá)的上調(diào)（P均< 0.05）。 結(jié)論 來曲唑通過cAMP-PKA信號(hào)通路影響子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2和TIMP-2的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 來曲唑；子宮肌瘤細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；金屬蛋白酶組織抑制因子-2；cAMP-PKA信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）16-0004-04

子宮肌瘤是育齡期女性最常見的生殖系統(tǒng)良性腫瘤，以月經(jīng)異常、陰道不規(guī)則流血、腹痛、子宮增大和臨近器官壓迫等為主要臨床癥狀[1]。子宮肌瘤的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前還沒有闡明。目前的研究認(rèn)為子宮肌瘤是一種依賴于激素的良性腫瘤[2]。芳香化酶是雌激素合成的關(guān)鍵酶，芳香化酶抑制劑可抑制雌激素的合成，降低體內(nèi)雌激素的水平，從而消除雌激素促進(jìn)子宮肌瘤生長(zhǎng)的作用。來曲唑是人工合成的第3代芳香化酶抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，其作用機(jī)制也不局限于雌激素途徑，在許多婦科疾病中都具有良好的應(yīng)用前景[3，4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮著十分重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）能抑制MMP-2的活性[5]。細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解之間的失衡在子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我們以前的研究結(jié)果顯示來曲唑能縮小子宮肌瘤患者肌瘤的體積，降低肌瘤組織中MMP-2的表達(dá)卻增加TIMP-2的表達(dá)[6]。cAMP-PKA信號(hào)通路是調(diào)節(jié)MMP表達(dá)的重要途徑[7]。因此本研究旨在探討cAMP-PKA信號(hào)通路在來曲唑下調(diào)MMP-2的表達(dá)和上調(diào)TIMP-2的表達(dá)中的作用，為來曲唑在子宮肌瘤的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）和來曲唑原藥（美國(guó)Sigma公司）。小牛血清（杭州四季青），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen公司），CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）和流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）。ABI7500熒光定量PCR儀及分析軟件（美國(guó)ABI公司）；GOS7500型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；垂直電泳儀（美國(guó)BioRad公司）；轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）。兔抗人α-actin、β-actin、MMP-2和TIMP-2抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），引物由上海生工提供。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集和細(xì)胞培養(yǎng) 選擇年齡在35～45歲之間的子宮肌瘤患者，術(shù)后經(jīng)病理切片確診為子宮肌瘤。將手術(shù)中切下的子宮肌瘤在無菌條件下取約1 cm3的肌瘤組織，PBS清洗肌瘤組織3遍，然后將肌瘤組織剪成碎片，加入含有Ⅰ型膠原酶（800 U/mL）的DMEM培養(yǎng)液，在37℃下消化5 h。吸取少量消化液滴于玻片上，用倒置顯微鏡觀察。當(dāng)出現(xiàn)組織塊已經(jīng)消化成分散的小的細(xì)胞團(tuán)或成單個(gè)細(xì)胞，加入含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，用不銹鋼網(wǎng)過濾。收集濾液，2 000 r/min離心10 min，吸掉上清，收集細(xì)胞。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h。用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見子宮肌瘤細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。由于子宮肌瘤細(xì)胞具有貼壁生長(zhǎng)的特性，倒掉培養(yǎng)基并換液而去掉未貼壁的細(xì)胞，從而分離子宮肌瘤細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。臺(tái)盼藍(lán)染色后觀察細(xì)胞活性并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基。子宮肌瘤細(xì)胞的鑒定方法為免疫細(xì)胞化學(xué)法，采用抗體為α-actin抗體。呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)且生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞用于以后的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將子宮肌瘤細(xì)胞分為以下實(shí)驗(yàn)組：①單獨(dú)子宮肌瘤細(xì)胞組：在DMEM培養(yǎng)液中加入與其他實(shí)驗(yàn)組相同量的DMSO；②來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理48 h或來曲唑（10-6 mol/L）處理24、48和72 h組：來曲唑用DMSO溶解，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度控制在0.1%以內(nèi)；③cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89組：在培養(yǎng)基中加入H-89使其終濃度為10 μmol/L；④來曲唑+H-89組：在培養(yǎng)基中加入H-89使其終濃度為10 μmol/L，預(yù)處理30 min后，加入來曲唑處理。

1.2.3 Real-time PCR 處理時(shí)間結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，一步法采用Trizol試劑盒提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，把所提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-20℃條件下保存?zhèn)溆?。cDNA樣品按梯度稀釋，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包含PCR上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，2×Hot Star Taq Master Mix 12.5 μL，cDNA 4 μL，總反應(yīng)體系為30 μL，余下部分用滅菌去離子水補(bǔ)足。引物由上海生工生物工程公司合成，MMP-2引物上游序列為：5′-TCTGGTCCCTTGCAGCTAGT-3′，下游序列為：5′-TGGGACAAGAACCAGATCAC-3′；TIMP-2引物上游序列為：5′-ATCAGGGccAAAGDGGTCAGTG-3′，下游序列為：5′-GTCACAGAGGGTGATGTGCAT-3′。同時(shí)擴(kuò)增β-actin，作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，β-actin引物上游序列為：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCCTTAT-3′，下游序列為：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min預(yù)變性，激活Hot Star Taq DNA合成酶，94℃變性50 s，60℃退火80 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35個(gè)。實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析，以對(duì)照組為100%對(duì)目的基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot 處理時(shí)間結(jié)束后，收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，加入500 μL蛋白裂解液裂解細(xì)胞30 min，提取各組細(xì)胞的總蛋白。BAC法按試劑盒說明進(jìn)行操作，測(cè)定裂解液蛋白質(zhì)的濃度。取50 μg蛋白樣本加入2×SDS加樣緩沖液中，煮沸，充分變性蛋白質(zhì)。6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h而分離蛋白，電泳電壓為80 mV。將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀膜上，然后采用麗春紅染色法觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。用5%脫脂牛奶在室溫下孵育膜2 h，將非特異性抗原封閉。分別加入兔抗人MMP-2（1：150）、TIMP-2（1：150）和β-actin（1：200）的抗體，4℃下過夜。用TBST洗膜3次，每次洗5 min。加入羊抗兔二抗，二抗用辣根過氧化物酶標(biāo)記，4℃下孵育膜4 h，然后用TBST沖洗3次。按照試劑盒說明書的指導(dǎo)，采用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒將蛋白質(zhì)條帶顯示于X光片上，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片并對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用單因素方差分析比較組間差異；組間差異的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 來曲唑?qū)θ俗訉m肌瘤細(xì)胞中MMP-2和TIMP-2表達(dá)的影響

來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理人子宮肌瘤細(xì)胞48 h或來曲唑（10-6 mol/L）處理人子宮肌瘤細(xì)胞24、48和72 h后，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果如表1、表2和圖1所示，來曲唑以濃度和時(shí)間依賴的方式下調(diào)了人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)以濃度和時(shí)間依賴的方式上調(diào)了人子宮肌瘤細(xì)胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)（實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對(duì)照組之間、實(shí)驗(yàn)組不同濃度之間以及實(shí)驗(yàn)組相同濃度不同處理時(shí)間之間比較差異有顯著性，P值均<0.05）。

來曲唑（10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L）處理人子宮肌瘤細(xì)胞48 h后，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3（表1）。

來曲唑（10-6 mol/L）處理人子宮肌瘤細(xì)胞24、48和72 h后，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3（表2）。

2.2 cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89部分阻斷了來曲唑的作用

cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89（10 μmol/L）預(yù)處理30 min后，加入來曲唑（10-6 mol/L）處理48 h。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖2和圖3所示：H-89部分取消了由來曲唑誘導(dǎo)的人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=6.04，P < 0.05]和蛋白[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=6.23，P < 0.05]表達(dá)的下調(diào)和TIMP-2 mRNA[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=5.76，P < 0.05]和蛋白[q（來曲唑與來曲唑+H-89組）=5.89，P < 0.05]表達(dá)的上調(diào)。

cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89（10 μmol/L）預(yù)處理30 min后，加入來曲唑（10-6 mol/L）處理48 h。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。（A）：實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)顯示人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)圖；（B）：Blot技術(shù)顯示MMP-2蛋白表達(dá)水平；（C）：MMP-2蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)圖。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3。*P < 0.05，與對(duì)照組比較；#P < 0.05，與來曲唑組比較（圖2）。

cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89（10 μmol/L）預(yù)處理30 min后，加入來曲唑（10-6 mol/L）處理48 h。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)人子宮肌瘤細(xì)胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。（A）：實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)顯示人子宮肌瘤細(xì)胞中TIMP-2 mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)圖；（B）：Blot技術(shù)顯示TIMP-2蛋白表達(dá)水平；（C）：TIMP-2蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)圖。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，n = 3。*P < 0.05，與對(duì)照組比較；#P < 0.05，與來曲唑組比較（圖3）。

3 討論

子宮肌瘤是育齡期婦女生殖器系統(tǒng)最常見的良性腫瘤之一。目前手術(shù)切除是子宮肌瘤的主要治療手段，因此子宮肌瘤是導(dǎo)致子宮切除的主要原因之一，嚴(yán)重危害了育齡婦女的身心健康，因此尋找新的治療途徑具有十分重要的意義。子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)尚不完全清楚，目前大多數(shù)研究者認(rèn)為子宮肌瘤是一種依賴激素的疾病。

芳香化酶是合成雌激素的限速酶，該酶活性的抑制可阻斷雌激素合成。來曲唑是一種非甾體類具有高度特異性的第3代芳香化酶抑制劑，也是一種人工合成的三苯三唑類衍生物[8]。來曲唑與芳香化酶內(nèi)源性底物之間具有競(jìng)爭(zhēng)抑制，來曲唑與芳香化酶的活性位點(diǎn)可逆性結(jié)合后，抑制該酶的活性，減少雌激素的合成，因此臨床上來曲唑可用來治療依賴雌激素的疾病。有研究表明子宮肌瘤患者連續(xù)使用來曲唑（5 mg/d）12周后，子宮肌瘤體積減小的幅度達(dá)70%[9]。

MMP是一種依賴Zn2+的內(nèi)肽酶，也是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶。MMP通過降解細(xì)胞外基質(zhì)在傷口的愈合、胎兒的分娩以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用。MMP-2是MMP中降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的一種酶[10]。MMP的組織型抑制劑可1：1與MMP共價(jià)結(jié)合，從而抑制MMP的活性，是一種MMP的天然抑制因子。MMP和TIMP共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)的降解與合成之間的平衡。有研究發(fā)現(xiàn)MMP-2可以直接降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原，也可以間接激活其他MMP，降解細(xì)胞外基質(zhì)，使基底膜遭到破壞，從而使子宮肌瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)，參與了子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展[11]。研究表明子宮肌瘤組織中MMP-2的表達(dá)顯著高于正常子宮平滑肌組織而TIMP-2在子宮肌瘤組織中的表達(dá)也顯著低于正常子宮平滑肌組織[12]。

在我們的研究中，結(jié)果顯示來曲唑以濃度和時(shí)間依賴的方式下調(diào)了人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，卻上調(diào)了人子宮肌瘤細(xì)胞中TIMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明來曲唑減小肌瘤體積，改善子宮肌瘤患者的臨床癥狀可能與來曲唑下調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)和上調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中TIMP-2的表達(dá)有關(guān)。MMP-2和TIMP-2表達(dá)的調(diào)控涉及到多條信號(hào)通路，如cAMP-PKA途徑、Ras途徑和MAPK途徑等[13]，我們的結(jié)果顯示cAMP-PKA信號(hào)通路抑制劑H-89部分取消了來曲唑誘導(dǎo)的人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的下調(diào)和TIMP-2表達(dá)。這些結(jié)果表明來曲唑影響MMP-2和TIMP-2的表達(dá)可能涉及到cAMP-PKA信號(hào)通路。

總之，我們的研究證實(shí)來曲唑降低了人子宮肌瘤細(xì)胞中MMP-2表達(dá)和上調(diào)了TIMP-2的表達(dá)，其機(jī)制可能與cAMP-PKA信號(hào)通路激活有關(guān)。

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（收稿日期：2013-02-19）