內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷時(shí)EPO及EPOR表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 觀察內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷時(shí)EPO 及EPO受體表達(dá)。 方法 20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)PS組和對(duì)照組，LPS組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立內(nèi)毒素心肌損傷模型。對(duì)照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射6 h后于鼠尾部放血測(cè)定心肌損傷標(biāo)志物，斷頸活殺取出心臟組織測(cè)定EPO 及EPO受體濃度。 結(jié)果 LPS組血清心肌損傷標(biāo)志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均顯著高于對(duì)照組（t = 6.751、5.346、3.432，P < 0.05）。LPS組心臟組織EPO及EPO受體水平均顯著高于對(duì)照組（t = 2.587、4.306，P < 0.05）。 結(jié)論 內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷時(shí)存在EPO及EPO受體高表達(dá)，為外原性EPO在膿毒癥的心臟保護(hù)中的應(yīng)用提供了可行性。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)毒素；心肌損傷；促紅細(xì)胞生成素；促紅細(xì)胞生成素受體；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R363.1+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）18-0008-03

膿毒癥是臨床常見危重病之一，膿毒癥已成為世界上ICU患者死亡的主要原因，膿毒癥休克患者死亡率高達(dá)46.5%[1]。嚴(yán)重膿毒癥時(shí)心肌抑制的發(fā)生率高達(dá) 80%，發(fā)生心肌損傷達(dá) 40%，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[2]。細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素釋放入血是膿毒癥發(fā)生的關(guān)鍵，內(nèi)毒素可誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征從而造成多臟器損傷，特別是引起心肌抑制和心肌損傷，而目前對(duì)于膿毒癥心肌抑制和心肌損傷尚無有效的治療方法。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由人體中的腎小管周圍毛細(xì)血管床的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，EPO與促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）結(jié)合調(diào)控紅系干細(xì)胞增殖、分化、成熟，促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放入血的生物學(xué)作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)[3]，在發(fā)生貧血、缺氧、急性損傷等情況下則能夠?qū)?EPO 及其受體的產(chǎn)生起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。因此，本課題組于2009年11月～2010年1月通過內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷，并采用ELISA法測(cè)定心臟組織中EPO及EPOR濃度，以探討其可能的保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS， L2880）、3-去氮腺苷（3-deazaadenosine）、EPO（CSB-E04539 m）及EPO受體（CSB-E0732l m）均為 Sigma公司產(chǎn)品，ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠20只，（體重300～320 g，SPF級(jí)，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），按清潔級(jí)大鼠的要求標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。20只大鼠隨機(jī)分為脂多糖（LPS）組和對(duì)照組各10只。LPS組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立內(nèi)毒素心肌損傷模型[4]。對(duì)照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)

①心肌損傷標(biāo)志物測(cè)定：腹腔注射6 h后于鼠尾部放血約0.5 mL/只，低溫3000轉(zhuǎn)/min離心15 min分取血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆么郎y(cè)心肌損傷標(biāo)志物，包括：心肌肌鈣蛋白I（cTnⅠ）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，采用ELISA檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物的濃度，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。②EPO及EPOR濃度的測(cè)定：腹腔注射6 h后鼠尾部放血后立即斷頸活殺取出心臟組織于-20℃保存，然后取心肌組織標(biāo)本在冰凍條件下研磨，制備心肌組織勻漿液，采用ELISA檢測(cè)EPO及EPOR濃度，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定A值，先測(cè)得樣本的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及A值計(jì)算出EPO及EPOR的相對(duì)濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間EPO及EPOR和心肌損傷標(biāo)志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS組和對(duì)照組大鼠心肌損傷標(biāo)志物水平檢測(cè)結(jié)果比較

大鼠在腹腔注藥6 h后測(cè)定血清心肌損傷標(biāo)志物水平，結(jié)果顯示，LPS組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均顯著高于對(duì)照組（t =6.751、5.346、3.432，P < 0.01）。見表1。

3討論

目前，我國(guó)膿毒癥患者的死亡率居高不下，約為20%～40%，其中50%的膿毒癥患者出現(xiàn)心肌受損[5]，防治內(nèi)毒素性心肌損傷對(duì)降低膿毒癥患者的死亡率具有十分重要的意義。LPS是由O-抗原、核心多糖和類脂A三部分構(gòu)成的革蘭陰性細(xì)菌外表層的一種生物大分子，其中只有LPS分子的類脂A基團(tuán)具有內(nèi)毒素活性，細(xì)菌類脂A基團(tuán)一旦侵入人體內(nèi)可以誘發(fā)多種疾病[6]。感染性休克、敗血癥、多器官功能性衰竭等臨床常見的革蘭陰性菌所致的疾病均與類脂A密切相關(guān)[7]。國(guó)外的研究報(bào)道[8]，內(nèi)毒素可以激發(fā)多細(xì)胞因子參與機(jī)體反應(yīng)，并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致心肌損傷的重要機(jī)制之一。cTnⅠ、CK、CK-MB是反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷較為敏感的指標(biāo)。當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血、缺氧等因素發(fā)生變性壞死，cTnI外漏并通過受損的細(xì)胞膜彌散進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，隨之進(jìn)入血管引起血清cTnI的升高[9]。CK-MB是一種細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)心肌缺血或者再灌注損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性升高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的CK、CK-MB大量入血[10]。CK和CK-MB特異性地反映心肌細(xì)胞受損程度，血清中CK和CK-MB越高，則表明心肌受損越嚴(yán)重。本研究在腹注LPS后，LPS組大鼠血清cTnⅠ、CK 、CK-MB水平顯著高于對(duì)照組，提示LPS能引起心臟組織功能的病理學(xué)改變，同時(shí)也提示本研究建立內(nèi)毒素心肌損傷模型是成功的。

人類EPO基因由 166 個(gè)氨基酸殘基組成，定位于 7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂 22 區(qū)（7q22），體內(nèi)EPO主要由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，腎臟分泌入循環(huán)。EPO的作用是維持紅細(xì)胞造血前體細(xì)胞的存活并促進(jìn)其分裂，誘導(dǎo)晚期紅系祖細(xì)胞生長(zhǎng)成為成熟的紅細(xì)胞[11]。EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過位于骨髓紅系祖細(xì)胞表面的特異性 EPO 受體來完成的，EPO及EPOR結(jié)合發(fā)揮生物活性，激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。據(jù)研究報(bào)道[13]，EPO及EPOR的高表達(dá)可能與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、新生血管生成有著密切的關(guān)系；此外，EPO及EPOR信號(hào)途徑在生理及病理的促進(jìn)心、腦損傷修復(fù)等多方面起重要作用[14]。近年來，EPO 參與胚胎的正常發(fā)育、促進(jìn)血管生成、組織保護(hù)作用、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化作用等多種非造血生物作用成為研究的熱點(diǎn)。但目前尚無證據(jù)證明EPO及EPOR在心肌損傷是否也存在其表達(dá)水平上調(diào)尚不清楚，有內(nèi)毒素性心肌損傷的發(fā)病機(jī)制還存有爭(zhēng)議，因此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方式來研究?jī)?nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷時(shí)EPO及EPOR的表達(dá)水平有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

研究結(jié)果顯示，在腹注LPS后，LPS組大鼠心肌細(xì)胞EPO及EPOR濃度明顯高于對(duì)照組，表明內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷時(shí)存在EPO及EPOR高表達(dá)，提示體內(nèi)感染可能是 EPO 及其受體生成的主要刺激因素，分析其原因可能是急性感染導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損，EPO及EPOR濃度速度上升，使EPO及EPOR調(diào)控系統(tǒng)失活，從而使EPO對(duì)心臟的保護(hù)作用減弱，這為外源性EPO在膿毒癥的心臟保護(hù)中的應(yīng)用提供了可行性。

[參考文獻(xiàn)]

[2] 張荷英. 膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素分析[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2012， 50（24）：35-37.

[3] Manfred N，Thomas S，Andrea S，et al. The pleiotropic effects of erythropoietin in infection and inflammation[J]. Microbes and Infection，2012，14（3）： 238-246.

[4] Reiko O，Shigeto O，Taka-aki N，et al. Differential pattern of cell-surface and soluble TREM-1 between sepsis and SIRS[J]. Cytokine，2013，61（1）：112-117.

[5] 柴振中，唐成武，馮文明，等. 阿片受體激動(dòng)劑 DADLE 對(duì)膿毒癥大鼠血清HMGB1 表達(dá)的影響及其作用的研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2012， 50（30）：4-6.

[6] Amanda RM，José BN，Maria BM，et al. Zymomonas mobilis culture protects against sepsis by modulating the inflammatory response，alleviating bacterial burden and suppressing splenocyte apoptosis[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2013，48（1）：1-8.

[7] Maohong C，Xiang T，Wei，et al. Upregulation of ras homolog enriched in the brain （Rheb） in lipopolysaccharide-induced neuroinflammation[J].Neurochemistry Internationa，2013，62（4）：406-417.

[8] Hinz K，Larsen LB，Wellnitz O，et al. Proteolytic and proteomic changes in milk at quarter level following infusion with escherichia coli lipopolysaccharide[J]. Journal of Dairy Science，2012，95（4）：1655-1666.

[9] 何志剛，李延來，王京龍. 閉合性胸部外傷合并心肌損傷患者心肌標(biāo)志物變化意義的研究[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010，26（10）：1024-1025.

[10] 景可. HIE患兒血清肌酸激酶同功酶檢測(cè)及其臨床意義[J]. 江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2007，25（2）：181-182.

[11] Philip RM，Lee AM. Pharmacological targets in the renal peritubular microenvironment： Implications for therapy for sepsis-induced acute kidney injury[J]. Pharmacology Therapeutics，2012，134（2）：139-155.

[12] Tetsuhiro T，Masaomi N. Recent advances and clinical application of erythropoietin and erythropoiesis-stimulating agents[J]. Experimental Cell Research，2012，318（9）： 1068-1073.

[13] Shin SK，Sung JM，Sung KH，et al. Immunogenicity of recombinant human erythropoietin in Korea： A two-year cross-sectional study[J]. Biologicals，2012，40（4）： 254-261.

[14] Konstantinos HK，Athina T，Dimitra N，et al. Recombinant human erythropoietin in patients with inflammatory bowel disease and refractory anemia： A 15-year single center experience[J]. Journal of Crohn's and Colitis，2012，6（1）：56-61.

（收稿日期：2013-04-11）