副波長選擇對免疫抑制法測定肌酸激酶同工酶活性的影響

[摘要] 目的 探討副波長選擇對西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀免疫抑制法測定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的影響。 方法 選擇不同副波長對溶血、黃疸、脂血等干擾樣本和正常對照血清樣本進行測定。 結果 副波長寬度的選擇對外觀正常對照樣本血清影響差異無統計學意義（P > 0.05）。以405 nm、480 nm、450 nm、505 nm為副波長的雙波長法檢測血紅蛋白、膽紅素、乳糜血等干擾樣本，干擾樣本與對照間差異有統計學意義（P <0.05）。 結論 免疫抑制法檢測CK-MB應根據樣本干擾物的種類來選擇不同的副波長。

[關鍵詞] 副波長；CK-MB；血紅蛋白；膽紅素；乳糜血

[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）18-0108-02

肌酸激酶（Creatine Kinase，CK） 是人體能量代謝過程中的重要酶類，由肌肉（M）型和腦（B）型兩種單體亞單位組成，包括CK-MB、CK-MM和CK-BB三種同工酶，其中CK-MB對于診斷急性心肌梗死有重要作用，是應用最廣泛的心肌損傷指標之一[1]。目前酶法測定CK-MB活性最常用的是免疫抑制法，研究發現輕微溶血、膽紅素、乳糜血對測定結果影響較小，但中度及重度溶血、膽紅素、乳糜血會嚴重影響測定結果.副波長的選擇可以消除部分干擾。干擾物對某些生化指標的影響已有文獻報道，但不同副波長選擇對免疫抑制法測定CK-MB抗干擾的研究較少，本文就副波長的選擇測定CK-MB的影響作一些探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ADVIA 2400全自動生化分析儀購于德國西門子公司；免疫抑制法CK-MB試劑盒購于寧波美康生物科技股份有限公司，批號為20120417；游離膽紅素及結合膽紅素購于百靈威科技有限公司，批號分別為LK50L19和JH10-4286；血紅蛋白購于上海瑞齊生物科技有限公司，批號為20101203；中/長鏈脂肪乳注射液（C6-C24）購于華瑞制藥有限公司，批號：80DH066。

1.2 檢測方法

收集本院生化室2012年2月份外觀正常體檢標本50份，應用免疫抑制法檢測CK-MB活性，所有測定嚴格按試劑盒說明書進行操作。測試條件如下：溫度：37 ℃；比色杯光徑為1.0 cm；檢測主波長340 nm；樣品（校準管以校準品做樣品）加R1混勻，37℃孵育5 min后加入R2混勻，37℃孵育2 min，連續監測1～3 min吸光度變化，計算每分鐘的吸光度變化，其中樣本用量10 μL，試劑1用量200 μL，試劑2用量50 μL。選擇好儀器測試程序后，將副波長依次設為無、405、450、480、505、546、570、600、660、700、750 nm，其他參數不變，取正常血清50份測其CK-MB，然后分別制備溶血（游離血紅蛋白濃度>400 mg/L以上）、脂血（總膽固醇濃度>4.8 mmol/L）和黃疸（總膽紅素濃度>50 mmol/L）干擾標本，選擇不同的副波長測定CK-MB活性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理。正態分布的計量資料以（x±s）表示，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均值間差異采用單因素方差分析，P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

不同副波長測定干擾樣本和正常對照樣本結果見表1。當樣本外觀正常時（無溶血、黃疸、脂血），不同副波長測定結果差異無統計學意義（F=5.00，P=0.6415）。溶血干擾樣本在405 nm 副波長的測定結果與對照樣本差異有統計學意義（t=3.452，P=0.003）。脂血干擾樣本在480 nm 副波長的測定結果與對照樣本差異有統計學意義（t=5.124，P=0.000）。膽紅素干擾樣本，在使用405、450、480、505 nm 副波長時，其測定結果與對照樣本相比差異有統計學意義（P均<0.05）。

3 討論

自動生化分析儀可選擇單波長或雙波長測定，單波長測定易受溶血、脂濁等因素的干擾， 而恰當組合的雙波長測定可通過副波長加以修正， 減少甚至消除干擾因素， 使結果更加可靠，如不合理使用雙波長測定則不僅不能消除干擾，甚至會使干擾幅度增強，干擾方向變得混亂[2，3]。

CK-MB是應用最廣泛的心肌損傷指標之一[1]，其準確測定對于心肌損傷早期診斷及梗死范圍大小或再梗死的估計有重要意義。本實驗結果顯示，當樣本外觀正常時（無溶血、黃疸、脂血），使用不同副波長的雙波長法測定結果差異不大，但當樣本受膽紅素、血紅蛋白、脂血干擾時，結果差異就很明顯。膽紅素是體內鐵卟啉化合物的代謝產物，在血清中有3種存在形式：未結合膽紅素、結合膽紅素和共價結合于清蛋白的膽紅素，由于膽紅素性質不穩定，容易異構化、烯醇化及自行氧化， 并且其光譜學特性還與其存在的介質密切相關，因此，在不同樣本、不同檢測環境中，其干擾程度及形式大相徑庭[4]。本實驗結果顯示，當選擇405、450、480、505 nm副波長時，膽紅素對檢測的正干擾非常顯著；采用546、570、600、660 nm副波長條件下，膽紅素干擾現象不明顯，此結果也符合此前報道的具有較強降低膽紅素干擾的雙波長組合[5]。溶血也是臨床檢驗工作中經常遇到的樣本異常問題，通過分析我們發現，對于血紅蛋白干擾樣本，僅在使用405 nm副波長時，其測定結果與對照樣本有顯著差異。由于溶血對檢驗結果的影響包括很多方面，如紅細胞內外成分濃度差；內、外液成分之間反應的干擾；有色物質對吸收光譜的干擾；溶血樣本中血紅素中正鐵離子的干擾等。前期研究發現，溶血后紅細胞內富含的腺苷酸激酶與ADP反應生成ATP，ATP參與CK、CK-MB活性檢測反應會導致其假性升高，所以溶血對CK-MB的檢測存在干擾[6]。而本文實驗結果沒有得到類似結論，推測可能與僅添加血紅蛋白作為干擾物有關。

本文采用“配對差異”實驗對不同副波長下CK-MB抗干擾能力進行考察，此法通過把一個潛在的干擾物質添加到樣本中，評價其相對于未加干擾物的對照樣本的偏差來判斷該物質是不是干擾物質。由于是人為加入干擾物，因此存在一些局限性：如添加化合物的特性可能不同于那些在體內自然循環狀態下的化合物；實驗樣本基質并不代表典型的有問題的臨床樣本；樣本中真實的干擾物可能不是原來的藥物，而是代謝產物；試驗濃度水平可能選擇太低或太高以致不真實等[7-11]。但此法也是目前臨床應用最廣泛的干擾評價試驗，有其獨特的優點，如可以提高效率，提供更多的信息，與一次一個檢測相比需要的分析物較少，干擾物質之間及干擾物與分析物之間的相互作用都能夠被評價等[12]。

綜上所述，本文采用“配對差異”干擾評價試驗，為正確的設置測試參數以避免臨床應用中膽紅素及血紅蛋白對免疫抑制法CK-MB測定干擾提供了依據。根據本文結果，免疫抑制法CK-MB檢測應避免340/405 nm、340/450 nm、340/480 nm、340/505 nm組合的雙波長法測試程序。

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（收稿日期：2013-03-21）